鹽酸法舒地爾通過活化Akt與抑制PTEN減輕順鉑導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡*

孔德陽(yáng),　郝建兵,　葉向梅,　唐　杰,　包娜娜,　侯冬華

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150081)

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鹽酸法舒地爾通過活化Akt與抑制PTEN減輕順鉑導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡*

孔德陽(yáng)△,郝建兵,葉向梅,唐杰,包娜娜,侯冬華

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150081)

[摘要]目的： 探討鹽酸法舒地爾(fasudil)能否通過活化Akt并抑制PTEN減輕順鉑(CP)導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。方法: 健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(每組12只)，包括正常對(duì)照(control)組、CP組及CP+fasudil組。生理鹽水或順鉑腹腔注射96 h后處死SD 大鼠，留取血液和腎臟組織，檢測(cè)血尿素氮(BUN)、血清肌酐(sCr)水平。PAS染色光鏡觀察腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化；TUNEL染色檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；分別采用Western blotting法和/或免疫組化技術(shù)檢測(cè)Rho蛋白激酶1(ROCK1)、PTEN、Akt 蛋白表達(dá)變化及磷酸化Akt(p-Akt)水平。結(jié)果: 與control組比較，CP組與CP+fasudil組大鼠的BUN及sCr水平、凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率、ROCK1及PTEN蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，而p-Akt表達(dá)則顯著減少(P<0.05)；PAS染色光鏡示CP組腎臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷性變化；與CP組比較，CP+fasudil組的sCr水平、凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率、ROCK1及PTEN蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，而p-Akt水平則顯著增高(P<0.05)；此外，腎臟病理?yè)p傷減輕。 結(jié)論: 鹽酸法舒地爾可以減輕順鉑引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與活化Akt及抑制PTEN蛋白表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]鹽酸法舒地爾； 順鉑； 急性腎損傷； 細(xì)胞凋亡； Rho蛋白激酶1

抗癌藥物順鉑(cisplatin，CP)腎毒性的主要靶位是腎小管上皮細(xì)胞，CP導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制之一是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡。如何減輕CP引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡是防治CP相關(guān)AKI的重要治療手段。

Rho蛋白是小G蛋白家族成員，是所有真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子開關(guān)。RhoA是Rho家族的主要成員，RhoA的主要功能是通過與下游的效應(yīng)蛋白R(shí)ho/Rho激酶 (Rho-associated protein kinase，ROCK)相互作用來實(shí)現(xiàn)的。 Rho激酶可以通過激活其特異性底物人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)從而使Akt失活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，多種AKI動(dòng)物模型中存在Rho 激酶活化，抑制Rho激酶活化能夠改善AKI[1]； 同時(shí)，Rho激酶信號(hào)途徑參與了CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，應(yīng)用其特異性抑制劑鹽酸法舒地爾(fasudil)能夠有效改善CP導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡[2]。然而，Rho激酶信號(hào)途徑參與的CP-AKI發(fā)病機(jī)制及鹽酸法舒地爾改善CP-AKI具體作用機(jī)制仍未得到深入研究。因此，本研究即采用CP-AKI模型進(jìn)行了如下研究。

材料和方法

1動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，6～8周齡，200～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2主要試劑

鹽酸法舒地爾由天津紅日藥業(yè)股份有限公司提供；順鉑(山東齊魯制藥)；TUNEL染色試劑盒 (Promega)；兔抗ROCK1、Akt及p-Akt多克隆抗體和小鼠抗PTEN抗體(Santa Cruz)；小鼠β-actin單克隆抗體(Sigma)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠IgG(中國(guó)廣州碧云天公司)。

3主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)SD大鼠分組36只SPF級(jí)健康SD雄性大鼠，隨機(jī)分為3組，每組12只：正常對(duì)照(control)組，單純腹腔注射0.9%生理鹽水(5 mL/kg)；CP組，單純腹腔注射CP(10 mg/kg)，CP+fasudil組：fasudil(20 mg/kg)于CP注射前72 h開始注射(每天1次，連續(xù)7 d[3])。

3.2腎臟組織標(biāo)本的留取將control組、CP組及CP+fasudil組大鼠于生理鹽水或CP注射后96 h，用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，腹正中切口，取出雙腎，分別分離腎周圍脂肪囊和腎筋膜后，用動(dòng)脈夾夾閉腎臟動(dòng)靜脈，切除整個(gè)腎，用冰鹽水沖洗后迅速沿冠狀面切成薄片，部分置于4%多聚甲醛液中固定48 h，用于制備石蠟切片；部分液氮冷凍后-80 ℃凍存，用于提取蛋白質(zhì)，用Western blotting等分析。

3.3血清標(biāo)本的留取大鼠處死時(shí)采取腹主動(dòng)脈穿刺取血，取血后室溫靜置4 h后，3 000 r/min4 ℃離心15 min分離血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4血清肌酐(serum creatinine，sCr)及尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的測(cè)定全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI)進(jìn)行測(cè)定血清肌酐及血尿素氮水平。

3.5碘酸-希夫氏(periodic acid-Schiff，PAS)染色腎組織標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、2 μm切片、脫蠟、用過PAS染色觀察腎組織病理變化。

3.6TUNEL與半定量分析石蠟包埋的腎臟組織，按試劑盒說明采用TUNEL檢測(cè)。結(jié)果根據(jù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每個(gè)腎臟觀察2～3張切片，每張切片隨機(jī)攝取6～8個(gè)不重疊視野。計(jì)數(shù)每個(gè)視野中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞凋亡程度以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比表示[4]。

3.7Western blotting實(shí)驗(yàn)組織提取蛋白：組織中加入預(yù)冷后RIPA細(xì)胞裂解液30 μL～200 μL，超聲破碎儀組織溶解，冰浴，離心，提取上清，-80 ℃保存；使用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白樣本在100 ℃下變性5 min，用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，立春紅染色后去離子水沖洗膜，放入封閉袋內(nèi)加封閉液封閉約4 h；加入多克隆兔抗ROCK1(1∶500)、Akt(1∶500)及p-Akt(1∶500) I 抗，小鼠抗PTEN(1∶200)I 抗4 ℃過夜；以 β-actin為內(nèi)參照，用ImageJ凝膠圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

3.8免疫組化腎組織標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、2 μm切片；二甲苯脫蠟；于保濕盒內(nèi)3% H2O2室溫浸30 min，PBS洗滌；微波法抗原修復(fù)：切片浸于枸櫞酸鉀溶液微波至微沸騰，暫停3～4 min，再加熱至微沸騰，反復(fù)4次；室溫放置30 min，自然冷卻；室溫下，將抗原在保濕盒內(nèi)血清封閉30 min；滴加1∶500稀釋的ROCK1抗體，4 ℃過夜；第2天將保濕盒取出，于室溫放置30 min，PBS洗滌；滴加 II 抗(生物素標(biāo)記)，于室溫放置50 min，PBS洗滌；滴加VECTASTAIN?R.T.U.ABC Reagent，室溫放置30 min，PBS洗滌；普通光鏡下DAB顯色1～10 min，邊顯色邊觀察；自來水沖洗，PBS浸5 min；復(fù)染：應(yīng)用蘇木素染液，PBS沖洗返藍(lán)；乙醇梯度脫水；樹膠封片；于高倍鏡下觀察(×400)。由一位獨(dú)立觀察者隨機(jī)選取5個(gè)視野/切片(×100)，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。按陽(yáng)性所占比例進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0，陰性；1，1%～20%； 2，21%～50%；3，51%～80%；4，81%～100%[5]。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1鹽酸法舒地爾治療可以降低順鉑誘導(dǎo)AKI大鼠的BUN、sCr水平，改善腎小管損傷

與control組比較，順鉑注射96 h，CP組與CP+fasudil組的sCr、BUN水平明顯升高(P<0.05)；注射鹽酸法舒地爾可以顯著減低SD大鼠的sCr水平(P<0.05)。順鉑注射96 h，近端腎小管刷狀緣脫落，管型堵塞腎小管，腎小管基底膜裸露。提前注射鹽酸法舒地爾可減少CP注射后96 h腎臟中壞死腎小管數(shù)量，腎小管損傷減輕，見圖1。

Figure 1.The levels of sCr (A), BUN (B) and morphological changes of the rat renal tissues (C) in the rats with different treatments (PAS staining, ×400 ). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCP group.

圖1各組血清sCr、BUN水平及腎臟的病理改變

2鹽酸法舒地爾治療抑制了ROCK1活化

2.1免疫組化結(jié)果在順鉑或生理鹽水經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)后96 h，用免疫組化結(jié)果顯示：與control組相比，CP組及CP+fasudil組ROCK1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與CP組相比較，CP+fasudil組ROCK1蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見圖2。

2.2Western blotting結(jié)果與control組比較，CP組及CP+fasudil組ROCK1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。與CP組比較，CP+fasudil組ROCK1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of ROCK1 was detected by immunohistochemistry (A, ×400) and Western blotting (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCP group.

圖2免疫組化法及Western blotting法檢測(cè)各組ROCK1蛋白的表達(dá)

3鹽酸法舒地爾治療可以減輕順鉑誘導(dǎo)AKI大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡

3.1TUNEL染色結(jié)果CP組見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(核呈榕褐色)大部分位于腎臟皮髓交界處的腎小管管壁和管腔內(nèi)；control組幾乎未見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞；CP+fasudil組可見少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，見圖3。

Figure 3.TUNEL-staining of renal tubular epithelium cells apoptosis in each group (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCP group.

圖3TUNEL染色檢測(cè)各組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡狀況

3.2凋亡評(píng)分結(jié)果CP組和CP+fasudil組凋亡程度顯著高于control組(P<0.05)；與CP組比較，CP+fasudil組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞比例降低(P<0.05)，見圖3。

4鹽酸法舒地爾通過活化Akt及抑制PTEN改善順鉑誘導(dǎo)AKI大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡

與control組比較，CP組及CP+fasudil組PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)，而p-Akt蛋白水平顯著減少(P<0.05)。與CP組比較，CP+fasudil組PTEN蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下調(diào)， p-Akt蛋白水平顯著增加(P<0.05)；各組Akt無顯著差異，見圖4。

Figure 4.Fasudil hydrochloride prevented CP-induced renal tubular epithelial cells apoptosis via the Akt activation and PTEN inhibition. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsCP group.

圖4鹽酸法舒地爾通過活化Akt及抑制PTEN減輕CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡

討論

CP易于在腎臟外髓的近端小管上皮細(xì)胞，特別是S3段蓄積，從而引起AKI，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡[6]。Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機(jī)體組織中普遍存在的一條信號(hào)通路，它參與許多細(xì)胞功能(如細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡等)的調(diào)節(jié)，Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否參與了CP-AKI時(shí)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡尚未明了。探究Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同CP-AKI時(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并對(duì)CP-AKI大鼠模型進(jìn)行Rho激酶特異性抑制劑鹽酸法舒地爾干預(yù)，觀察阻斷Rho激酶信號(hào)通路對(duì)CP-AKI時(shí)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，探究具體的作用機(jī)制，能夠?yàn)獒槍?duì)CP-AKI誘導(dǎo)的腎小管上皮凋亡尋找新靶點(diǎn)藥物治療提供思路。

ROCK是參與細(xì)胞有絲分裂、骨架調(diào)整及肌肉細(xì)胞收縮等一系列生命現(xiàn)象重要的酶[7]。ROCK底物參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)： ROCK可以直接磷酸化激活PTEN，從而抑制Akt活性[8-9]。Akt能通過抑制內(nèi)、外源性凋亡途徑在促進(jìn)細(xì)胞存活中起重要作用。

鹽酸法舒地爾作為目前臨床唯一可用的Rho激酶抑制劑，能夠強(qiáng)效擴(kuò)血管，保護(hù)缺血腦組織，且已經(jīng)在多種AKI模型中證實(shí)發(fā)揮了腎臟保護(hù)作用[1]。

腎小管上皮細(xì)胞凋亡是CP-AKI的重要發(fā)病機(jī)制之一。在我們的研究中，TUNEL染色顯示CP組腎小管有大量的凋亡細(xì)胞，然而，CP+fasudil組腎小管中凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯減少；表明Rho激酶抑制劑明顯減輕CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。ROCK分為ROCK1及ROCK2，前者主要存在于非神經(jīng)組織如肝臟、睪丸與腎臟等，后者主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如大腦皮質(zhì)及小腦浦肯野細(xì)胞等[6]。研究中，我們同時(shí)測(cè)定了ROCK1與PTEN蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果證實(shí)了ROCK1調(diào)節(jié)凋亡的重要性：Rho激酶活化使PTEN表達(dá)上調(diào)，從而抑制Akt活性，凋亡增加。PTEN在調(diào)節(jié)Akt活性方面發(fā)揮著重要作用，研究表明，PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)能夠減輕腎臟小管上皮細(xì)胞的凋亡進(jìn)而改善橫紋肌溶解大鼠的腎臟損傷[3]。本研究中，CP注射后的大鼠PTEN蛋白表達(dá)增加，經(jīng)法舒地爾干預(yù)治療的模型鼠PTEN蛋白表達(dá)明顯下降。因而，我們推測(cè)法舒地爾調(diào)節(jié)腎臟保護(hù)主要是通過抑制PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)Akt磷酸化增加凋亡減少。PTEN與ROCK1活性改變的一致性，使我們推斷法舒地爾對(duì)PI3K/Akt信號(hào)途徑的影響似乎是由于通過抑制ROCK活性進(jìn)而抑制PTEN蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的生存信號(hào)途徑，作為生存因子， Akt活化能夠改善細(xì)胞凋亡。相反，抑制了PI3K/Akt途徑，能夠?qū)е录?xì)胞凋亡，這種原理已經(jīng)開始在腎臟腫瘤的治療方面應(yīng)用[10]。研究表明，PI3K敲除的大鼠腎臟細(xì)胞凋亡和CP-AKI明顯惡化[11]。在正常細(xì)胞中，PTEN具有磷酸酶活性，可以使PIP3脫磷酸形成PIP2，使其喪失信使功能，從而抑制PI3K/Akt通路，活化的Akt是PI3K/Akt通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵。 Rho激酶能夠通過上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt通路的活化進(jìn)而促進(jìn)凋亡。眾所周知，Akt活化是預(yù)防CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的主要因素之一。Nozaki等[2]表明ROCK抑制能夠預(yù)防CP誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，然而，未對(duì)參與的具體信號(hào)通路進(jìn)行闡明。Kentrup等[12]亦報(bào)道了抑制ROCK通路能夠增加Akt的活性，改善缺血再灌注腎臟的損傷。Kong等[13]指出維持Akt活性能夠減輕腎臟小管上皮細(xì)胞CP毒性。本研究中，我們觀察到法舒地爾治療明顯使注射CP大鼠降低的Akt磷酸化水平增加，表明ROCK抑制劑能夠通過抑制PTEN蛋白表達(dá)，活化PI3K/Akt通路。

綜上所述，從本研究可以認(rèn)為法舒地爾能夠有效地抑制CP-AKI時(shí)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PTEN表達(dá)進(jìn)而活化Akt相關(guān)。然而，應(yīng)用PI3K/Akt途徑特異性抑制劑進(jìn)行深入研究，證實(shí)該分子機(jī)制在法舒地爾腎臟保護(hù)方面的重要性仍是不可缺少的。

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*[基金項(xiàng)目]廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2011GXNSFA018177)；廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No. 2010A060801016)資助

Fasudil hydrochloride prevents cisplatin-induced renal tubular epithelial cell apoptosis via Akt activation and PTEN inhibitionKONG De-yang, HAO Jian-bing, YE Xiang-mei, TANG Jie, BAO Na-na, HOU Dong-hua

(DepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China.E-mail:cangsang01@tom.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the protective effect of fasudil hydrochloride against cisplatin(CP)-induced renal tubular epithelial cell apoptosis via Akt activation and PTEN inhibition. METHODS: Healthy male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, CP group and CP+ fasudil group. All animals were sacrificed 96 h after injection of 0.9% saline or CP. Blood samples and kidney tissues were collected to evaluate levels of blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (sCr) and morphological alteration of the kidneys, respectively. The apoptosis of renal tubular epithelium cells was detected by TUNEL. Protein levels of Rho-associated protein kinase 1 (ROCK1), PTEN and Akt were measured by Western blotting and immunohistochemistry. The protein level of p-Akt was analyzed by Western blotting. RESULTS: Compared with control group, the sCr and BUN levels, the expression of ROCK1 and PTEN and TUNEL-positive cells were increased, while the level of p-Akt was decreased in CP group and CP+fasudil group. The histological structure of the kidneys observed by PAS staining was developed marked structural damage in CP group(P<0.05). Compared with CP group, sCr level， the expression of ROCK1 and PTEN and TUNEL-positive cells were decreased, while the level of p-Akt was increased in CP+fasudil group (P<0.05). Very little structural damage was detected in fasudil-treated groups. CONCLUSION: Fasudil hydrochloride has a protective effect on CP-induced renal tubular epithelial cell apoptosis via Akt activation and PTEN inhibition 1.

[KEY WORDS]Fasudil hydrochloride; Cisplatin; Acute kidney injury; Apoptosis; Rho-associated protein kinase 1

通訊作者△Tel: 0771-5356516； E-mail: assheep@163.com

[收稿日期]2015- 04- 28[修回日期] 2015- 10- 16

[文章編號(hào)](責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)1000- 4718(2015)12- 2259- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.024

[中圖分類號(hào)]R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A