蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解的影響*

王　青，　張　云,　 毛紅嬌，　王金萍，　賈如如，　金麗芳，　戴智睿

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

?

蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解的影響*

王青，張?jiān)啤? 毛紅嬌，王金萍，賈如如，金麗芳，戴智睿

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

[摘要]目的： 觀察蛇床子素對(duì)磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解的影響。方法: 采用TCP顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，于術(shù)后第2天顱頂局部注射蛇床子素(osthole)20 mg/kg，每周3次，持續(xù)干預(yù)2周。干預(yù)結(jié)束后處死動(dòng)物取材，應(yīng)用HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)染色觀察假體周圍破骨細(xì)胞生成和骨溶解程度；ELISA法檢測血清和骨組織中骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物骨鈣素(osteocalcin)水平、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和TRACP活性以及骨膜中腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平。Western blot法檢測顱骨組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CAAT/ enhancer binding protein homologous protein，CHOP)的表達(dá)變化。結(jié)果: 蛇床子素可明顯抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，減少骨溶解面積，顯著增加ALP和osteoclacin水平，降低TRAP活性并阻斷炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β釋放。此外，蛇床子素干預(yù)能明顯減弱TCP顆粒激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)論: 蛇床子素可抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解，其機(jī)制可能與抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]磷酸三鈣顆粒； 破骨細(xì)胞； 骨溶解； 蛇床子素； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

新近假體翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)聚乙烯、陶瓷和金屬類等3類松動(dòng)假體周圍聚集大量的磨損顆粒，這些顆?？哨吇⒓せ罴袤w周圍單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞，使其大量增殖并分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等因子[1]；這些炎癥因子可直接或間接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、活化，最終導(dǎo)致假體周圍骨溶解和假體松動(dòng)[2]。因此，磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解是人工關(guān)節(jié)無菌性松動(dòng)和關(guān)節(jié)翻修的主要原因之一。

由于翻修術(shù)治療假體松動(dòng)其療效低于初次手術(shù)，手術(shù)創(chuàng)傷大、價(jià)格昂貴等原因，目前臨床上多使用雙膦酸鹽抑制假體周圍骨溶解，但是這類藥物中遠(yuǎn)期療效欠佳，而且容易誘發(fā)骨壞死及心房纖維性顫動(dòng)[3]。此外，目前也有學(xué)者嘗試通過基因療法治療假體周圍骨溶解并取得一定的效果，然而基因治療在國內(nèi)外均處于起步階段，存在影響范圍大、毒副作用不清楚等風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，利用中藥現(xiàn)代化技術(shù)從天然藥用植物中尋找新的高效、低毒藥物抑制假體周圍骨溶解十分必要。

蛇床子素(osthole)又名甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是最先從傘形科植物蛇床中分離出的天然香豆素類化合物。有研究證實(shí)蛇床子素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病和神經(jīng)保護(hù)等作用。近年有研究表明蛇床子素具有雌激素樣作用，能明顯抑制大鼠去卵巢誘導(dǎo)的高骨轉(zhuǎn)換，可減少骨丟失和治療骨質(zhì)疏松[5-6]。此外，蛇床子素還具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)堿性磷酸酶(alkaline-phosphatase, ALP)活性和增加膠原合成等作用[7]；但是對(duì)于蛇床子素能否影響磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和抑制骨吸收，目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用小鼠顱骨溶解模型研究蛇床子素對(duì)磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響，并探討其可能作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用蛇床子素防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1動(dòng)物

6周齡ICR雄性小鼠36只，體重18～22 g，由浙江省軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK(浙)2011-0015，合格證號(hào)為4402101912。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，溫度22～28 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。

2主要試劑

TCP顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈(zèng)；蛇床子素(純度≥99.8%)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；鱟試劑購自上海吳昊經(jīng)貿(mào)有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)染色試劑盒購自Sigma；ALP 活性檢測試劑盒、TRACP活性檢測試劑盒、RIPA裂解液和ECL顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；骨鈣素ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；兔源性葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體、兔源性CCAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)抗體和小鼠β-actin抗體購自CST；PVDF膜購自Millipore。

3主要方法

3.1TCP顆粒的準(zhǔn)備TCP顆粒經(jīng)電鏡掃描顯示TCP顆粒平均粒徑為1.997 μm，其中90%的顆粒小于3.2 μm，顆粒容易發(fā)生聚集(圖1)。將TCP顆粒置于70%乙醇溶液，室溫振蕩浸泡48 h后去除乙醇。再經(jīng)無水乙醇浸泡，沉淀48 h后去除乙醇，干燥后取30 mg用玻璃紙分裝，將顆粒置于250 ℃恒溫箱中3 h。采用鱟試劑法檢測TCP顆粒表面內(nèi)毒素含量小于0.25 Eu·mg-1·mL-1。表明該顆粒表面內(nèi)毒素低于該試劑盒的最低檢測線，排除內(nèi)毒素污染。

Figure 1.SEM image of the TCP particles.

圖1TCP顆粒掃描電鏡圖

3.2小鼠顱骨溶解模型的建立用乙醚麻醉小鼠，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm。分離皮下組織，顯露出1 cm×1 cm顱骨區(qū)域。其中假手術(shù)(sham)組進(jìn)行原位縫合，其余組取TCP顆粒30 mg置于顱頂后縫合皮膚。蛇床子素組小鼠于術(shù)后第2天顱頂局部注射蛇床子素(20 mg/kg)，每周3次，持續(xù)干預(yù)2周。假手術(shù)組小鼠顱頂局部注射生理鹽水，注射時(shí)間與蛇床子素一致。干預(yù)結(jié)束后各組小鼠通過摘除眼球取血，用于血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物和炎癥因子檢測；同時(shí)取出顱骨(以正中矢狀線為中心的方形區(qū)域)，PBS清洗后稱顱骨濕重，取顱骨骨膜檢測炎癥因子，再提取骨組織分析破骨細(xì)胞形成、骨溶解以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白的表達(dá)。

3.3HE染色顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h和10% EDTA(pH 7.4)脫鈣2周后，石蠟包埋、切片，厚度為7 μm。HE染色后置于IX70顯微鏡觀察。利用Image-Pro Plus 5.0(Media Cybernetics)計(jì)算正中矢狀縫區(qū)域三核及以上破骨細(xì)胞數(shù)。

3.4TRACP染色顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min，0.25 mol/L氫氧化銨超聲清洗5 min。系列乙醇脫水(50%、80%、90%、100%)后自然晾干，加入TRACP 37 ℃避光染色60 min。蒸餾水清洗后，置于IX70顯微鏡下觀察。

3.5血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物與炎癥因子釋放的檢測小鼠，血液置于4 ℃冰箱放置30 min，1 500 r/min離心10 min取上層血清。采用ALP、TRACP和骨鈣素試劑盒檢測血清中上述骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的變化。

取顱骨骨膜，剪碎后加入200 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min。經(jīng)12 000 r/min離心 15 min后收集上清，分別用TNF-α、IL-1β和IL-6等ELISA試劑盒測定骨膜中上述炎癥因子的變化。

3.6骨組織蛋白提取與ALP和TRACP活性測定每組各取3只小鼠顱骨，剪成1 mm×1 mm× 1 mm碎片；加入液氮研磨成粉末后加入800 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min。12 000 r/min離心 15 min后收集上清液，BCATM試劑盒檢測各組蛋白濃度。分別采用ALP和TRACP等試劑盒測定顱骨組織ALP和TRACP的活性。

3.7Western blot實(shí)驗(yàn)顱骨組織蛋白加入上樣緩沖液煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg，進(jìn)行12% SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，分別加入兔源性I抗CHOP(1∶1 000)、GRP78(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1蛇床子素對(duì)小鼠體重和顱骨濕重的影響

從表1可以看出，實(shí)驗(yàn)開始至結(jié)束，假手術(shù)組、TCP顆粒組、蛇床子素組(20 mg/kg)小鼠體重均相似，無顯著差異，表明蛇床子素對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TCP顆粒組顱骨濕重明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，而蛇床子素組小鼠顱骨濕重大于TCP顆粒組(P<0.05)，提示蛇床子素顯著抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨丟失。

表1蛇床子素對(duì)小鼠體重和顱骨濕重的影響

Table 1.The effects of osthole on body weight and calvaria weight (Mean±SD.n=3)

GroupBodyweight(g)StartingFinalCalvariaweight(mg)Sham22.6±1.636.1±3.689.6±5.1TCP23.1±2.735.2±2.165.1±2.6*Osthole22.4±2.135.6±1.880.8±4.1#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

2蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解的影響

HE和TRACP染色結(jié)果表明假手術(shù)組破骨細(xì)胞數(shù)較少、骨溶解面積較小。TCP顆粒植入后可誘導(dǎo)大量破骨細(xì)胞生成和大面積骨溶解，破骨細(xì)胞數(shù)和骨溶解面積增加，分別為假手術(shù)組的6.22倍和8.87倍(P<0.05)。結(jié)合顱骨濕重結(jié)果，提示TCP顆粒可誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解。而蛇床子素組能顯著抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞數(shù)和骨溶解面積(P<0.05)，見圖2、3。

3蛇床子素對(duì)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物和炎癥因子釋放的影響

ALP和骨鈣素分別為成骨細(xì)胞早期分化和成熟的標(biāo)志；TRACP為破骨細(xì)胞特征酶，因此，ALP、骨鈣素和TRAP被認(rèn)定為是骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物[8]。為觀察蛇床子素對(duì)上述骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的影響，本研究應(yīng)用ALP、骨鈣素和TRAP試劑盒分別檢測蛇床子素處理后血清和骨組織中這些指標(biāo)的變化。血清學(xué)結(jié)果顯示TCP組小鼠血清ALP活性和骨鈣素水平明顯降低，而TRACP活性顯著增加，ALP活性和骨鈣素分別為假手術(shù)組的73.24%和8.39%，TRACP活性為假手術(shù)組的3.79倍。蛇床子素干預(yù)能提高血清ALP活性和骨鈣素水平(P<0.05)，同時(shí)顯著抑制血清TRACP活性(P<0.05)。另外，TCP顆粒植入后顱骨組織中ALP活性顯著降低且TRACP活性顯著升高，與血清學(xué)檢測結(jié)果一致。而蛇床子素干預(yù)后骨組織中ALP活性升高，TRAP活性降低(P<0.05)，見表2。

Figure 2.The effects of osthole on TCP particles-induced osteoclastogenesisinvivo(HE staining). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

圖2蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞生成的影響

Figure 3.The effects of osthole on TCP particles-induced osteolysis in the mouse calvaria (TRACP staining). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

圖3蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響

表2蛇床子素對(duì)骨轉(zhuǎn)化標(biāo)志物的影響

Table 2.The effects of osthole on the level of bone turnover markers (Mean±SD.n=3)

IndexShamTCPOstholeSerumlevelALP(U/L)71.40±16.0052.30±11.40*65.10±19.10*#Osteocalcin(μg/L)8.46±0.590.71±0.03*2.26±0.90*#TRAP(U/L)1.71±0.326.48±0.84*2.36±0.55*#CalvariaALPactivity(U/g)11.70±0.346.69±0.76*9.45±0.91*#TRAPactivity(U/g)0.57±0.071.12±0.06*0.66±0.09#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

另外，本研究通過ELISA法檢測骨膜TNF-α、IL-6和IL-1β水平，觀察炎癥因子在蛇床子素抑制磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解中的作用。如表3所示，TCP顆粒組小鼠顱骨骨膜中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯升高，分別增加為假手術(shù)組的4.92倍、10.18倍和17.38倍(P<0.05)，表明TCP顆?？烧T導(dǎo)假體周圍細(xì)胞釋放炎癥因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、活化和骨吸收[3]。蛇床子素干預(yù)能抑制上述炎癥因子釋放，其骨膜中TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著減少，僅為TCP顆粒組的37.82%、23.24%和22.96%(P<0.05)。

表3蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6釋放的影響

Table 3.The effects of osthole on TCP particles-induced the release of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the periosteum (ng/L. Mean±SD.n=3)

GroupTNF-αIL-6IL-1βSham72.34±4.3243.60±2.2215.91±1.21TCP356.17±2.14*443.97±5.16*276.54±5.17*Osthole134.71±0.91*#103.19±6.98*#63.49±3.43*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

4蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響

有研究證實(shí)TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子不僅在假體周圍破骨細(xì)胞和骨溶解中發(fā)揮重要作用，還可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR通路激活[9-10]，參與調(diào)控炎癥性骨溶解疾病的發(fā)生和發(fā)展[11]。為探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路是否參與蛇床子素抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的炎癥性骨溶解，本研究應(yīng)用分子免疫印跡方法檢測骨組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TCP顆粒可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白GRP78和CHOP表達(dá)增加，分別為假手術(shù)組的14.31倍和2.40倍(P<0.05)。而蛇床子素處理后GRP78和CHOP表達(dá)為TCP顆粒組的42.87%和33.99%，其中蛇床子素對(duì)CHOP抑制作用更明顯(P<0.05)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路可能參與蛇床子素抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解，見圖4。

Figure 4.The effects of osthole on TCP particles-induced ER stress response. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

圖4蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響

討論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)常用于治療嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病，然而假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)常常會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)置換失敗和關(guān)節(jié)二次翻修。因此，如何通過抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解，防治假體松動(dòng)已經(jīng)成為目前人工關(guān)節(jié)發(fā)展的重要課題。本研究證實(shí)蛇床子素可抑制假體周圍破骨細(xì)胞活化和功能，阻斷小鼠顱骨溶解，其機(jī)制可能與阻斷TCP顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。

蛇床子素是從傘形科植物蛇床成熟果實(shí)蛇床子中提取的香豆素類化合物，具有抗心律失常、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗腫瘤和抗細(xì)胞凋亡等多種生物活性。另有研究認(rèn)為蛇床子素可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制破骨細(xì)胞形成而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。但是蛇床子素是否對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的炎癥性骨吸收有影響？目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用TCP顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，觀察蛇床子素對(duì)TCP顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解的影響。結(jié)果顯示20 mg/kg蛇床子素可明顯抑制假體周圍破骨細(xì)胞生成，阻斷TCP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解，同時(shí)伴隨骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物ALP活性和osteocalcin水平的明顯升高及TRACP活性的顯著降低。

聚乙烯、金屬和陶瓷顆粒可刺激假體周圍單核/巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞等組織細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，這些炎癥因子可促進(jìn)破骨細(xì)胞活化并誘導(dǎo)骨溶解，提示炎癥因子在磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要的作用，可作為假體周圍骨溶解和人工關(guān)節(jié)松動(dòng)的治療靶點(diǎn)。我們采用ELISA檢測到TCP顆?？烧T導(dǎo)TNF-α和IL-1β釋放，增加骨膜中TNF-α和IL-1β水平，與Ding等[12]研究結(jié)果基本一致。另外，我們還觀察到TCP顆粒組小鼠骨膜中IL-6水平顯著增加，表明TCP顆?？烧T導(dǎo)IL-6的釋放，而Ding等[12]和Obando-Pereda等[13]卻認(rèn)為氧化鋯陶瓷顆粒不能刺激體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，其原因尚需進(jìn)行更深入的研究論證。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)蛇床子素干預(yù)可顯著抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β產(chǎn)生，導(dǎo)致小鼠骨膜中TNF-α和IL-6水平分別減少為TCP顆粒組的37.82%、23.24%和22.96%，阻斷破骨細(xì)胞生成和假體周圍骨溶解。結(jié)合表2數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)蛇床子素抑制TCP顆粒誘導(dǎo)炎癥因子的釋放比其對(duì)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的影響更明顯。由此推測，抑制假體周圍炎癥因子的釋放是蛇床子素阻止TCP顆粒誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞形成和骨溶解的機(jī)制之一。但是其發(fā)揮治療作用具體機(jī)制尚不清楚。

最近有研究顯示炎癥因子不僅可誘導(dǎo)假體周圍破骨細(xì)胞的生成和骨吸收，而且還能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)[8-9]。例如，Brozzi等[14]研究發(fā)現(xiàn)在1型糖尿病中，炎癥因子IL-1β和IFN-γ可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)TCP顆粒植入小鼠顱骨后可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路標(biāo)志蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。另外，Wang等[11]也報(bào)道：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-PBA可明顯阻斷TiPs/CoPs 顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6，造成破骨細(xì)胞生成和骨溶解減少。以往研究和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍炎癥介質(zhì)的釋放、破骨細(xì)胞生成和骨溶解。蛇床子素干預(yù)明顯抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，減少GRP78和CHOP表達(dá)，提示蛇床子素抑制TCP顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解可能是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，蛇床子素可抑制TCP顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨溶解，有望成為治療和預(yù)防磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的候選藥物，減少TCP磨損顆粒所致的骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dumbleton JH, Manley MT, Edidin AA. A literature review of the association between wear rate and osteolysis in total hip arthroplasty[J]. J Arthroplasty, 2002, 17(5):649-661.

[2]Merkel KD, Erdmann JM, McHugh KP, et al. Tumor necrosis factor-alpha mediates orthopedic implant osteoly-sis[J]. Am J Pathol, 1995, 154(1):203-210.

[3]Abu-Amer Y, Darwech I, Clohisy JC. Aseptic loosening of total joint replacements: mechanisms underlying osteolysis and potential therapies[J]. Arthritis Res Ther, 2007, 9 (Suppl 1):S6.

[4]Huang JB, Ding Y, Huang DS, et al. RNA interference targeting p110 β reduces tumor necrosis factor-alpha production in cellular response to wearparticlesinvitroand osteolysisinvivo[J]. Inflammation, 2013, 36(5):1041-1054.

[5]明磊國，王鳴剛，陳克明，等. 蛇床子素對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞骨吸收及細(xì)胞凋亡的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012, 47(2):174-179.

[6]Li XX, Hara I, Matsumiya T. Effects of osthole on postmenopausal osteoporosis using ovariectomized rats; comparison to the effects of estradiol[J]. Biol Pharm Bull, 2002, 25(6):738-742.

[7]Tang DZ, Hou W, Zhou Q, et al. Osthole stimulates osteoblast differentiation and bone formation by activation of beta-catenin-BMP signaling[J]. J Bone Miner Res, 2010, 25(6):1234-1245.

[8]Smith BJ, Bu SY, Wang Y， et al. A comparative study of the bone metabolic response to dried plum supplementation and PTH treatment in adult, osteopenic ovariectomized rat[J]. Bone, 2014, 58:151-159.

[9]Cardozo AK, Ortis F, Storling J, et al. Cytokines downregulate the sarcoendoplasmic reticulum pump Ca2+ATPase 2b and deplete endoplasmic reticulum Ca2+, leading to induction of endoplasmic reticulum stress in pancreatic β-cells[J]. Diabetes, 2005, 54(2):452-461.

[10]Allagnat F, Klee P, Cardozo AK, et al. Connexin36 contributes to INS-1E cells survival through modulation of cytokine-induced oxidative stress, ER stress and AMPK activity[J]. Cell Death Differ, 2013, 20(12):1742-1752.

[11]Wang R, Wang Z, Ma Y, et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening[J]. Biomaterials, 2013, 34 (11):2611-2623.

[12]Ding Y, Qin CQ, Fu YR, et al.Invitrocomparison of the biological activity of alumina ceramic and titanium particles associated with aseptic loosening[J]. Biomed Mater, 2012, 7(4):045019.

[13]Obando-Pereda GA, Fischer L, Stach-Machado DR， et al. Titanium and zirconia particle-induced pro-inflammatory?gene expression in cultured macrophages and osteolysis, inflammatory hyperalgesia and edemainvivo[J]. Life Sci, 2014, 97(2):96-106.

[14]Brozzi F, Gerlo S, Grieco FA, et al. A combined “omics” approach identifies N-Myc interactor as a novel cytokine-induced regulator of IRE1 protein and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic beta cells[J]. J Biol Chem, 2014, 289(30):20677-20693.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81200606);廣東省科技計(jì)劃(No.2012B031800313);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2015A030313458);廣州市屬高?？萍加?jì)劃(No.1201410467);廣州市科技計(jì)劃(No.201510010201)

Effect of osthole on tricalcium phosphate particles-induced calvarial osteolysis in a mouse modelWANG Qing, ZHANG Yun, MAO Hong-jiao, WANG Jin-ping, JIA Ru-ru, JIN Li-fang, DAI Zhi-rui

(CollegeofMedicine,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:zhangyunbme@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of osthole on tricalcium phosphate (TCP) particles-induced calvarial osteolysis in vivo.METHODS: Male ICR mice were randomly divided into sham group, TCP group and osthole group. A mouse calvarial model of osteolysis was established by TCP particles. On the second postoperative day, osthole (20 mg/kg) was locally injected into the calvarium under the periosteum 3 times a week. Two weeks after osthole treatment, blood and calvaria were collected to determine the level of bone turnover markers such as alkaline phosphatase(ALP), osteocalcin and tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP). The periosteum was performed to examine the release of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-1β by ELISA. The calvaria was obtained for histological and molecular analyses. RESULTS: Data from HE and TRACP staining revealed that osthole prevented TCP particles-induced obvious increase in osteoclastogenesis and resorption area in the metaphysis of mouse calvaria. Osthole treatment increased ALP activity and osteocalcin level, and dncreased the activity of TRACP in the mouse serum compared with TCP group. Furthermore, TCP particles-induced the releases of TNF-α, IL-6 and IL-1β were significantly suppressed by osthole treatment. In addition, Western blot demonstrated that endoplasmic reticulum (ER) stress markers such as glucose-regulated protein 78 (GRP78) and CAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) were significantly up-regulated in TCP particles-implanted calvarial mice, indicating that TCP particles triggered an ER stress response in the mouse calvarial osteolysis model, which obviously attenuated by osthole. CONCLUSION: Osthole inhibits TCP particles-induced calvarial osteolysis in mice, which is mediated by inhibition of ER stress signaling pathway.

[KEY WORDS]Tricalcium phosphate particles; Osteoclast; Osteolysis; Osthole; Endoplasmic reticulum stress

通訊作者△Tel: 020-37103213； E-mail: yang-chuntao@163.com

[收稿日期]2015- 09- 03[修回日期] 2015- 10- 20

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2271- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.026

[中圖分類號(hào)]R285.5； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A