白花丹醌對人肝星狀細(xì)胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影響*

楊成芳，　李　麗，　李勇文，　鐘毓娟，　熊美麗，　方舒萍

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

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白花丹醌對人肝星狀細(xì)胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影響*

楊成芳，李麗△，李勇文，鐘毓娟，熊美麗，方舒萍

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

[摘要]目的： 研究白花丹醌(plumbagin)對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)刺激的體外培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4 )的mRNA和蛋白表達(dá)、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達(dá)的影響。方法: 體外培養(yǎng)HSC-LX2，隨機(jī)設(shè)立空白組、TGF-β1刺激的模型組、TGF-β1+ plumbagin (2 μmol/L、1.5 μmol/L及1 μmol/L)組；細(xì)胞與各藥物共同孵育72 h后，采用RT-PCR檢測細(xì)胞Nox4 mRNA的表達(dá)；原位裝載探針法測定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nox4和α-SMA的蛋白含量。結(jié)果: 與模型組比較，白花丹醌作用72 h后，2 μmol/L和1.5 μmol/L plumbagin能明顯降低HSC-LX2細(xì)胞Nox4 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)ROS水平，降低α-SMA的蛋白表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論: Plumbagin可能是通過下調(diào)Nox4的表達(dá)進(jìn)而降低ROS生成從而發(fā)揮其抑制HSC-LX2細(xì)胞活化的作用。

[關(guān)鍵詞]白花丹醌； 轉(zhuǎn)化生長因子β1； HSC-LX2細(xì)胞； NADPH氧化酶4； 活性氧簇； α-平滑肌肌動蛋白

研究顯示氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)人肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)與HSCs的活化密切相關(guān)，其活化后高表達(dá)的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)具有調(diào)節(jié)、分泌細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，這些是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)、一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶、細(xì)胞色素P450氧化酶和黃嘌呤氧化酶等所催化的反應(yīng)過程中均伴有ROS的產(chǎn)生[3]。 Nox至少有7種亞型，在肝臟中Nox4是介導(dǎo)ROS產(chǎn)生的最主要的Nox亞型，在肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞內(nèi)Nox4的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它亞型[4-5]。由Nox4產(chǎn)生的ROS可介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路激活，促進(jìn)HSCs的激活并抑制其凋亡，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成[4,6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)白花丹醌能抑制HSC的增殖與活化，國內(nèi)也有相關(guān)的研究，但其通過抗氧化應(yīng)激作用抑制HSC-LX2細(xì)胞株的增殖與活化尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是作用最強(qiáng)的促肝纖維化因子[8-9]。本研究擬用TGF-β1刺激HSC-LX2細(xì)胞建立活化的HSC-LX2細(xì)胞模型，旨在探討白花丹醌抑制HSC-LX2細(xì)胞活化的分子機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞來源人肝星狀細(xì)胞株HSC-LX2(博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2藥物與試劑白花丹醌、維生素E(vitamin E，Vit E)和LY364947(TGF-β1受體抑制劑)均購自Sigma；高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；TGF-β1、novoprotein、RNApure高純總RNA快速提取試劑盒和2×Taq PCR Master Mix(北京艾德萊生物)；TIANScript cDNA 第1鏈合成試劑盒(TIANGEN)；兔抗人Nox4單克隆抗體(上海生工)；鼠抗人GAPDH/α-SMA單克隆抗體(Aidlab Biotechnologies)； HRP 標(biāo)記山羊抗兔/兔抗鼠 II 抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)； ROS探針(Cayman)。

1.3主要儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；PTC-220多通道PCR儀(MJ)；核酸蛋白測定儀(Shimadzu)；倒置相差顯微鏡(Zeiss)；DYY-6D凝膠電泳儀/電泳槽(北京賽因坦科技有限公司)；JS-780全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技)；蛋白電泳儀/電轉(zhuǎn)膜儀(JY600C,上海生工)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肝星狀細(xì)胞系HSC-LX2置于10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長至70%～80%密度時(shí)用0.25%的EDTA胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次，每次實(shí)驗(yàn)均取呈指數(shù)生長的細(xì)胞進(jìn)行。

2.2MTT法檢測白花丹醌對TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2細(xì)胞活力的影響MTT操作步驟參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。對照組加入含終濃度為5 μg/L 的TGF-β1+終濃度為1 μmol/L的LY364947，各給藥組在對照組的基礎(chǔ)上加入含各濃度的藥物作用72 h，各組白花丹醌終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μmol/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞活力抑制率。細(xì)胞活力抑制率=(A對照組-A給藥組)/A對照組×100%。

2.3RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞分組及處理空白對照組：加入胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液；模型組：加入含TGF-β1終濃度為5 μg/L胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液；白花丹醌高、中、低濃度組：在加入終濃度為5 μg/L TGF-β1刺激24 h基礎(chǔ)上加入白花丹醌作用72 h，終濃度分別為2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L[11]。

2.4RT-PCR檢測HSC-LX2細(xì)胞 Nox4的mRNA表達(dá)采用TRIzol法抽提細(xì)胞中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量和純度，A260/A280均在1.8～2.0之間；取總RNA 5 μg，采用M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物，Nox4的上游引物序列為5’-CCGAACACTCTTGGCTTACC-3’，下游引物序列為5’-CACTGAGAAGTTGAGGGCATT-3’；β-actin的上游引物序列為5’-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物序列為5’-CGTACAGGTCTTTGCGGATGTC-3’。所得cDNA按2×Taq PCR Master Mix試劑盒說明，加2 μL cDNA模板擴(kuò)增基因片段，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL RT-PCR產(chǎn)物及8 μL DNA marker進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果經(jīng)培清JS-780全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，樣本Nox4的mRNA PCR產(chǎn)物條帶的光密度與內(nèi)參照β-actin的mRNA PCR產(chǎn)物條帶的光密度(A)比值作半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5原位裝載探針法檢測HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS的生成將呈指數(shù)生長的HSC-LX2細(xì)胞以每孔5×103的密度接種于6孔板，分為空白對照組、TGF-β1模型組、Vit E(200 mg/L)組[12]以及白花丹醌2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L組。藥物與細(xì)胞共孵育72 h后，棄培養(yǎng)基，除正常組外，各組加含TGF-β1終濃度為5 μg/L的培養(yǎng)基，置37 ℃孵育30 min，棄培養(yǎng)基，加入含ROS探針終濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育25 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nox4和α-SMA的蛋白含量低溫提取細(xì)胞總蛋白，改良BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加GAPDH、Nox4和α-SMA(1∶500) I 抗，4 ℃搖床過夜，洗膜，加 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后將超敏ECL發(fā)光液滴加到膜上，當(dāng)條帶充分顯色后，壓X光片，暗室曝光5～10 s，將X膠片進(jìn)行顯影、定影后可見到清晰條帶。所得膠片經(jīng)JS-780全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1白花丹醌對TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，HSC-LX2細(xì)胞經(jīng)過TGF-β1+LY364947處理后，白花丹醌在0.25～ 2 μmol/L之間對細(xì)胞活力的抑制率小于10%，說明白花丹醌在這個(gè)范圍內(nèi)對正常的HSC-LX2細(xì)胞的毒性較小。

Figure 1.The effect of plumbagin on the HSC-LX2 cells after treated with TGF-β1 and LY364947. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1白花丹醌對經(jīng)TGF-β1及LY364947作用后HSC-LX2細(xì)胞活力的影響

2白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞Nox4 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組HSC-LX2細(xì)胞中Nox4 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組相比，2 μmol/L組和1.5 μmol/L白花丹醌作用72 h后，HSC-LX2細(xì)胞Nox4 mRNA的表達(dá)明顯下降(P<0.01),見圖2。

3白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

原位裝載探針法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)綠色熒光明顯增強(qiáng)，表明ROS水平明顯升高。與模型組相比，Vit E組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號明顯減弱；白花丹醌各濃度組可不同程度下調(diào)ROS的表達(dá)，隨著白花丹醌濃度的增加，HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱且發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)明顯減少，白花丹醌2 μmol/L組與Vit E組細(xì)胞內(nèi)的熒光信號強(qiáng)度相當(dāng)，見圖3。

Figure 2.The effect of plumbagin on the mRNA expression of Nox4 in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖2白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞Nox4 mRNA表達(dá)的影響

4白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞Nox4和α-SMA蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后,HSC-LX2細(xì)胞內(nèi)Nox4和α-SMA的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，2 μmol/L和1.5 μmol/L濃度白花丹醌作用72 h后，Nox4和α-SMA的蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

討論

肝星狀細(xì)胞是肝纖維化時(shí)產(chǎn)生過量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的主要來源細(xì)胞，其活化增殖是肝纖維化形成的關(guān)鍵。逆轉(zhuǎn)肝纖維化關(guān)鍵在于減少活化的HSCs數(shù)量[13-14]。HSCs活化時(shí)具有高度增殖活性并能轉(zhuǎn)化為高表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞，合成大量ECM，故α-SMA的表達(dá)被認(rèn)為是HSCs活化的顯著特征之一[15]

研究顯示，在各種炎癥刺激因子、生長因子和促纖維化因子中，TGF-β1是作用最強(qiáng)的促肝纖維化因子[8-9]，它除了能促進(jìn)HSCs的增殖與活化，還能通過自分泌機(jī)制產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)。據(jù)報(bào)道[4，16]，Nox在肝纖維化進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，在肝纖維化動物模型及肝纖維化病人病程中均伴隨Nox4的增加，其通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的凋亡和肝星狀細(xì)胞的活化促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。現(xiàn)已證明，由Nox4產(chǎn)生的ROS是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使[17]，介導(dǎo)了各種促肝纖維化因子在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，ROS可直接刺激HSCs的增殖與活化，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[1,18-19]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激后模型組HSC-LX2中Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)、ROS水平明顯升高、α-SMA蛋白呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)，表明活化的HSC-LX2細(xì)胞模型建立成功。

Figure 3.The effect of plumbagin on ROS production in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖3白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞ROS生成的影響

本課題組前期研究顯示白花丹醌能明顯抑制TGF-β1刺激的HSC-LX2細(xì)胞的增殖和活化，IC50為1.72 μmol/L，呈劑量依賴性[11]。本研究結(jié)果顯示HSC-LX2細(xì)胞經(jīng)過TGF-β1+LY364947處理后，白花丹醌在0.25～2 μmol/L之間對細(xì)胞活力的抑制率小于10%，說明白花丹醌在0.25～2 μmol/L范圍內(nèi)對正常HSC-LX2細(xì)胞的毒性較小，而對TGF-β1刺激的活化型HSC-LX2的生長具有明顯的抑制作用。TGF-β1刺激后模型復(fù)制成功后，給予白花丹醌作用72 h，HSCs中Nox4 mRNA及蛋白表達(dá)、ROS水平及α-SMA蛋白明顯減少，提示白花丹醌抑制HSCs增殖和活化功能的機(jī)制之一可能與抑制Nox4及ROS的表達(dá)等抗氧化功能有關(guān)，關(guān)于其抑制Nox4后ROS生成減少介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路的改變有待進(jìn)一步研究。

Figure 4.The effect of plumbagin on the protein expression of Nox4 and α-SMA in the HSC-LX2 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖4白花丹醌對HSC-LX2細(xì)胞中Nox4和α-SMA蛋白表達(dá)的影響

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*[基金項(xiàng)目]哈醫(yī)大一院科研基金(No. 2013Y01)

Effect of plumbagin on levels of Nox4/ROS and α-SMA in human hepatic stellate cellsYANG Cheng-fang, LI Li, LI Yong-wen, ZHONG Yu-juan, XIONG Mei-li, FANG Shu-ping

(GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China.E-mail: 31910753@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of plumbagin on the mRNA and protein expression of nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4 (Nox4)， reactive oxygen species (ROS) level and protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in the HSC-LX2 cells stimulated with transforming growth factor β1 (TGF-β1) in vitro. METHODS: HSC-LX2 cells were cultured in vitro and divided into blank group, model group, high-, medium- and low-dose (2, 1.5 and 1 μmol/L) plumbagin groups. After incubated with each drug for 72 h, the mRNA expression of Nox4 was detected by RT-PCR. ROS levels were tested by in situ loading probe method. The protein contents of Nox4 and α-SMA were measured by Western blot. RESULTS: Compared with model group, after treated with plumbagin for 72 h, the mRNA expression of Nox4, ROS level and α-SMA protein were significantly decreased in high-and medium-dose plumbagin groups (P<0.01). CONCLUSION: Plumbagin inhibits the activation of HSC-LX2 cells via decreasing the expression of Nox4, thus decreasing ROS levels.

[KEY WORDS]Plumbagin; Transforming growth factor-β1; HSC-LX2 cells; Nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4; Reactive oxygen species; α-Smooth muscle actin

通訊作者△Tel: 0451-85555208； E-mail： cangsang01@tom.com

[收稿日期]2015- 05- 11[修回日期] 2015- 10- 09

[文章編號](責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)1000- 4718(2015)12- 2254- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.023

[中圖分類號]R363.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A