西方蜜蜂的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基-I～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II富含A＋T非編碼區(qū)單倍型類群

李興安　牛慶生　薛運(yùn)波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108）

西方蜜蜂的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基-I～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II富含A＋T非編碼區(qū)單倍型類群

李興安牛慶生薛運(yùn)波

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108）

西方蜜蜂（Apis mellifera）的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）細(xì)胞色素氧化酶亞基-I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II（COII）富含A+T非編碼區(qū)（AT-rich noncoding region，NC）屬于高變異DNA序列，既呈現(xiàn)mtDNA長度變異又呈現(xiàn)mtDNA序列變異，它作為mtDNA多態(tài)性標(biāo)記廣泛地應(yīng)用于A.m.地理亞種的DraI酶限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，DraI RFLP）分析和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）分析。在本文中，A.m.非洲世系mtDNA的28種DraI RFLP譜圖被歸納為3種COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P1、Q元件組成類群以及P2、Q元件組成類群；A.m.西部歐洲世系mtDNA的90種DraI RFLP譜圖被歸納為1種COI-COII NC單倍型類群，即P、Q元件組成類群；A. m.東部歐洲世系mtDNA的25種SNP譜圖被歸納為1種COI-COII NC單倍型類群，即Q元件組成類群；A.m.亞洲世系mtDNA的29種DraI RFLP譜圖被歸納為3種COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P0'、Q元件組成類群以及P1'、Q元件組成類群。本文綜述了這個(gè)研究進(jìn)展。

西方蜜蜂；細(xì)胞色素氧化酶亞基-I～細(xì)胞色素氧化酶亞基-II非編碼區(qū)；線粒體DNA單倍型類群

西方蜜蜂（Apis mellifera，A.m.）是兼具生態(tài)環(huán)境保護(hù)（例如，保持植物多樣性）、設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展（例如，介導(dǎo)農(nóng)作物授粉）以及商業(yè)性養(yǎng)蜂生產(chǎn)（例如，促進(jìn)蜂蜜后熟）等多重價(jià)值的一個(gè)蜜蜂屬物種［1-4］。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，A.m.起源于非洲或（和）西部亞洲或（和）中部亞洲，并且在沿歐洲大陸擴(kuò)展過程中自然分布于西部歐洲和東部歐洲［5，6］。昆蟲形態(tài)變異分析（和昆蟲系統(tǒng)地理學(xué)分析）將A.m.大致劃分為24～29個(gè)地理亞種，或演化譜系，或親緣譜系，或系統(tǒng)發(fā)育分支［7-9］。事實(shí)上，相對(duì)于其它顯花植物傳粉昆蟲，A.m.具有低的種內(nèi)多樣性［10］；而且，A.m.種內(nèi)多樣性長期遭受商業(yè)性蜜蜂繁育、蜜蜂轉(zhuǎn)地飼養(yǎng)、外來蜜蜂輸入乃至蜜蜂蜂群崩潰綜合征等諸多非自然選擇因素的影響［11］。因此，伴隨A.m.自然分布格局逐漸消失和A.m.種群數(shù)量不斷減少，A.m.種內(nèi)多樣性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［9，12，13］。

蜜蜂保護(hù)研究的一個(gè)主要內(nèi)容是通過A.m.線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）單倍型分析獲得A. m.地理亞種的分子證據(jù)［14］。Cornuet等（1991）最初通過比較A.m.與黑腹果蠅近緣物種Drosophila yakuba的mtDNA同源區(qū)發(fā)現(xiàn)，A.m.的mtDNA細(xì)胞色素氧化酶亞基-I基因與CO亞基-II（COII）基因之間存在長串聯(lián)重復(fù)DNA序列，并且將其命名為COI-COII基因間隔序列［15］。之后，Crozier等（1993）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這段mtDNA特異序列尚存在1個(gè)亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（t-RNALeu）基因，t-RNALeu基因與COII基因之間的DNA序列如同mtDNA其它基因間隔序列，是富含A＋T（或T＋A）重復(fù)序列的非編碼區(qū)［16］。迄今為止，A.m.的mtDNA單倍型分析表明，NC是mtDNA在分子進(jìn)化過程中保留A.m.種內(nèi)多樣性“遺跡”的最豐富“印記”，它作為一種多態(tài)性mtDNA標(biāo)記已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于鑒定A.m.地理亞種［8］。大量文獻(xiàn)詳細(xì)報(bào)道了A.m.地理亞種的COI-COII單倍型，即A.m.地理亞種mtDNA多態(tài)性?？傮w上，A.m.地理亞種的COI-COII單倍型，既呈現(xiàn)mtDNA長度多態(tài)性規(guī)律又呈現(xiàn)mtDNA序列多態(tài)性規(guī)律，前者被表征為一系列DraI酶限制性片段長度多態(tài)性譜圖，后者被表征為一系列單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）譜圖。那么，這些研究成果意味著什么呢？

在非A.m.的mtDNA多態(tài)性相關(guān)文獻(xiàn)中，例如，甲殼綱（Crustacea）擊鉤蝦科（Talitridae）動(dòng)物mtDNA單倍型分析研究，NC序列被描述為COI-COII非編碼區(qū)（COI-COII NC）［17］。在此基礎(chǔ)之上，本文以COI-COII NC為mtDNA單倍型研究的技術(shù)指標(biāo)，進(jìn)一步將A.m.地理亞種歸納為不同的COI-COII單倍型類群。

1　A.m.的COI-NC-COII

A.m.的mtDNA全長16,343堿基［16］。如同其他高等昆蟲的mtDNA，A.m.的mtDNA由基因序列和基因間隔序列兩部分組成?；蛐蛄性趍tDNA全長范圍內(nèi)占據(jù)多數(shù)序列坐位，為長片段mtDNA,包括2個(gè)核糖體亞基基因、22個(gè)必需氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因和13個(gè)線粒體呼吸鏈組成型蛋白質(zhì)基因，在物種進(jìn)化過程中相對(duì)不變；基因間隔序列在mtDNA全長范圍內(nèi)占據(jù)少數(shù)序列坐位，為短片段mtDNA,包括1個(gè)mtDNA復(fù)制起始序列和多個(gè)NC，在物種進(jìn)化過程中相對(duì)可變［16，18，19］。mtDNA復(fù)制起始序列具有相對(duì)短的序列長度，呈現(xiàn)相對(duì)簡單的序列組成，涵蓋相對(duì)少的遺傳信息；NC具有相對(duì)長的序列長度，呈現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜的序列組成，涵蓋相對(duì)多的遺傳信息［15］。相對(duì)于A.m.的mtDNA其它NC，COI-COII NC是mtDNA高變異區(qū)［18］。

相對(duì)于黑腹果蠅近緣物種Drosophila yakuba的COI-COII NC序列長度（僅幾個(gè)堿基），A.m.的COICOII NC序列長度明顯地增長（達(dá)幾百乃至上千個(gè)堿基）［15］。按照DNA由5'端至3'端延伸的合成方向，A.m.的COI-COII NC以其5'端承接于t-RNALeu基因序列3'端，以其組成型序列P和序列Q（分別被命名為P元件和Q元件）形成組織結(jié)構(gòu)單元，以其3'端與COII基因序列5'端相延續(xù)［20］。P元件全長54個(gè)堿基，占據(jù)COI-COII NC的近5'端區(qū)段，具有相對(duì)均一的DNA序列組成；Q元件全長194個(gè)堿基，占據(jù)COI-COII NC的近3'端區(qū)段，具有相對(duì)不均一的DNA序列組成﹙即它的近5'端序列長度為48個(gè)堿基，是部分COI基因序列的同源片段，被命名為Q1序列；它的中間序列長度為78個(gè)堿基，是全長t-RNALeu基因序列的同源片段，被命名為Q2序列；它的近3'端序列全長為70個(gè)堿基，是P元件的同源片段，被命名為Q3序列﹚［15］。在A.m.的COI-COII NC中，多個(gè)連續(xù)堿基缺失和（或）插入導(dǎo)致mtDNA的限制性核酸內(nèi)切酶DraI酶切位點(diǎn)移碼,COICOII NC由此成為DraI RFLP多態(tài)性分析獲得mtDNA單倍型數(shù)據(jù)的一個(gè)遺傳學(xué)基礎(chǔ)［21］；另一方面，單個(gè)不連續(xù)堿基缺失和（或）插入及替換導(dǎo)致mtDNA的緊密連鎖位點(diǎn)點(diǎn)突變，COI-COII NC由此成SNP多態(tài)性分析獲得mtDNA單倍型數(shù)據(jù)的另外一個(gè)遺傳學(xué)基礎(chǔ)［14，21-24］。

在A.m.地理亞種的COI-COII NC單倍型分析中，mtDNA長度多態(tài)性既反映于P元件長度變異又反映于Q元件長度變異；mtDNA序列多態(tài)性僅反映于Q元件序列變異。對(duì)于P元件多態(tài)性，P元件缺失13個(gè)堿基時(shí)被命名為P0元件，缺失15個(gè)堿基時(shí)被命名為P1元件，缺失18個(gè)堿基時(shí)被命名為P2元件，全序列缺失意味著P元件從COI-COIINC“刪除”。對(duì)于Q元件多態(tài)性，Q元件2拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQ,3拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQ，4拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQQ，5拷貝串聯(lián)重復(fù)被命名為QQQQQ。

2　A.m.的COI-COII NC單倍型類群

非洲大陸及其近海島嶼是A.m.的自然分布區(qū)［5，8］。昆蟲形態(tài)變異分析（和昆蟲系統(tǒng)地理學(xué)分析），將分布于那里的非洲蜂等A.m.地理亞種（及其相關(guān)生態(tài)類型）概括為A.m.非洲世系［25］?；贒raI RFLP分析，本文將A.m.非洲世系樣本的28種DraI RFLP譜圖歸納為3種A.m.的COI-COII NC單倍型類群，即P0、Q元件組成類群，P1、Q元件組成類群以及P2、Q元件組成類群［21，26-31］。其中，P0、Q元件組成類群具有1個(gè)P0元件和4個(gè)不同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，至少包括P0Q、P0QQ、P0QQQ以及P0QQQQ 4種mtDNA單倍型類型［21，26-28，31］；P1、Q元件組成類群具有1個(gè)P1元件和3個(gè)不同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，至少包括P1Q、P1QQ以及P1QQQ 3種mtDNA單倍型類型［21］；P2、Q元件組成類群具有1個(gè)P2元件和2個(gè)相同串聯(lián)重復(fù)頻率Q元件，僅為P2QQ 1種mtDNA單倍型類型［21］。

（未完待續(xù)）

Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence AT-rich noncoding region haplotype groups of Apis mellifera species

Li Xing'an，Niu Qingsheng，Xue Yunbo
（Jilin Provincial Institute of Apicultural Science,Jilin 132108）

Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence AT-rich noncoding region（COI-COII NC）is specific for mtDNA of Apis mellifera（A.m.）.This region has considerable DNA variability in both length and sequence,for which it has been used extensively as a polymorphic marker of mtDNA for analyzing DraI RFLP and SNP among A.m.geographic subspecies.Here,mtDNA of A.m.lineage in Africa,which are characterized by 28 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 3 COI-COII NC haplotype groups of A.m.,i.e.the groups with both P and Q elements where P can also appear in two types of variations（P0and P1）；mtDNA of A.m.lineage in western Europe, which are characterized by 90 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 1 COI-COII NC haplotype group of A. m.,i.e.the group with both P and Q elements；mtDNA of A.m.lineage in eastern Europe,which are characterized by 25 SNP patterns,is induced to be composed of 1 COI-COII NC haplotype group of A.m.,i.e.the group only with Q element；mtDNA of A.m.lineage in western Asia,which are characterized by 29 DraI RFLP patterns,is induced to be composed of 3 COI-COII NC haplotype groups of A.m.,i.e.the groups with both P and Q elements where P can also appear in two types of variations（P0'and P1'）.We reviewed COI-COII NC haplotype groups of A.m..

Apis mellifera；Cytochrome C oxidase subunit I（COI）-COII ingtergenic sequence noncoding region；mtDNA haplotype groups

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20130101094JC；20140101132JC）、國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-45-KXJ2；CA2S-45-SYZ4）

李興安（1965-），男，研究員，E-mail：Lxingan@sina.com