小細(xì)胞肺癌驅(qū)動(dòng)基因研究進(jìn)展

佟冰 趙靜 王孟昭

肺癌發(fā)病率及死亡率均高居惡性腫瘤第一位，小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）約占肺癌總發(fā)病率10%-15%，其臨床特點(diǎn)和生物學(xué)行為異于其他類型肺癌，表現(xiàn)為倍增時(shí)間短，早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度極高。目前SCLC患者的治療仍以全身化療±同步放療為主，初治緩解率高，但復(fù)發(fā)率極高，且易發(fā)生耐藥，5年生存率不足5%。

隨著腫瘤分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase,ALK）突變基因的分子靶向藥物在肺腺癌患者中取得了滿意的療效及生存獲益，為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）開(kāi)辟了新的治療途徑。但SCLC的治療始終無(wú)明顯進(jìn)展，迫切需要新的有效治療手段。關(guān)于SCLC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制方面的各項(xiàng)研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，迄今尚未發(fā)現(xiàn)有效的分子治療靶點(diǎn)。其中一個(gè)重要原因可能是，絕大多數(shù)SCLC患者在就診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，無(wú)法獲取足夠的、令人滿意的手術(shù)病理標(biāo)本進(jìn)行大規(guī)模突變基因篩選。

目前，綜合已有的幾項(xiàng)較大規(guī)模SCLC全基因組測(cè)序結(jié)果，已知潛在的SCLC分子生物治療靶點(diǎn)主要包括抑癌基因TP53、RB-1、PTEN缺失或失活，PIK3CA、EGFR、c-MET、c-Kit過(guò)度表達(dá)，F(xiàn)GFR1、SOX2、MYC家族擴(kuò)增，其他可檢測(cè)到的還包括EP300、CREBBP、ZNF521、RUNX1T1、KMT2D等基因突變[1-5]。迄今為止，多種針對(duì)上述靶點(diǎn)的藥物已經(jīng)探索性地進(jìn)入臨床研究階段，然而尚無(wú)一種靶向治療能夠得到有效的臨床證實(shí)。2012年Byers等[6]報(bào)告了SCLC中兩個(gè)較為獨(dú)特的分子特征：果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源物-2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）和聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1［poly(ADP-ribose)polymerase, PARP-1］，提出二者作為SCLC潛在驅(qū)動(dòng)基因，有可能為SCLC治療開(kāi)辟新的方向。

1 EZH2和PARP-1

Byers等[6]應(yīng)用反向階段蛋白質(zhì)陣列技術(shù)，測(cè)定了34株SCLC細(xì)胞系及74株NSCLC細(xì)胞系共計(jì)193種蛋白表達(dá)水平情況。該研究發(fā)現(xiàn)，RTK、PI3K、RAS/MAP/ERK在SCLC中的活性以及表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NSCLC，但在SCLC中，轉(zhuǎn)錄基因E2F1調(diào)控因子如EZH2、DNA修復(fù)蛋白、胸苷酸合成酶、凋亡因子的表達(dá)水平明顯高于NSCLC，尤其以EZH2和PARP-1的升高為主。敲除EZH2和PARP-1基因后，SCLC細(xì)胞系的生長(zhǎng)受到明顯抑制。

1.1 EZH2 RB1/E2F信號(hào)傳導(dǎo)途徑異常存在于超過(guò)90%的SCLC，是其公認(rèn)的最具代表性的異常信號(hào)傳導(dǎo)通路[7]。Coe等[8]對(duì)14份SCLC病理標(biāo)本及14株SCLC細(xì)胞系進(jìn)行基因檢測(cè)，在全部標(biāo)本中均檢測(cè)到了RB1/E2F信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的異常，包括RB1抑癌基因缺失或突變、E2F家族擴(kuò)增。而無(wú)論是RB1丟失或E2F擴(kuò)增，最終都將激活其下游的EZH2基因。與此同時(shí)，Coe等[8]研究了EZH2在SCLC細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示EZH2基因的表達(dá)水平均有明顯升高。RB1抑癌基因主要通過(guò)抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子家族表達(dá)起到抑制細(xì)胞增殖作用，而E2F家族成員如E2F1在不同的人類癌癥微環(huán)境中可能起到促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞增殖這兩種截然相反的作用[9]。因此，存在于RB1/E2F信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游EZH2基因似乎更適合作為SCLC驅(qū)動(dòng)基因。

EZH2基因定位于人染色體7q35位點(diǎn)上，是多梳基因（polycomb group genes,PcG）家族重要成員之一。PcG家族是人體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一類重要表觀遺傳調(diào)控因子，家族成員間相互結(jié)合成多梳抑制復(fù)合體發(fā)揮作用，能使某些特定基因的沉默，在DNA修復(fù)中也起到一定作用[10]。EZH2是多梳抑制復(fù)合體2的關(guān)鍵催化亞單位，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成、基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及生長(zhǎng)控制等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

EZH2基因異常激活后可以甲基化組蛋白3的27號(hào)賴氨酸（histone H3 lysine 27, H3K27），與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases, HDACs）一起發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，沉默200多種抑癌基因的表達(dá)，亦可激活某些靶基因，導(dǎo)致惡性腫瘤形成發(fā)展[11,12]。Hubaux等[13]利用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）沉默SCLC細(xì)胞系中的EZH2基因表達(dá)后，觀察到處于S或G2/M期的細(xì)胞比例降低，p21蛋白水平升高，促凋亡因子Puma和Bad上調(diào)，細(xì)胞凋亡活性明顯增加，認(rèn)為這可能為EZH2在SCLC形成中的分子作用機(jī)制。

近年來(lái)，研究者們陸續(xù)在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)EZH2基因高表達(dá)現(xiàn)象[14-16]。其中，對(duì)乳腺癌、前列腺癌的研究顯示EZH2可能與腫瘤的高度侵襲性相關(guān)。有觀點(diǎn)認(rèn)為EZH2可以使某些抗轉(zhuǎn)移基因表達(dá)沉默，如E-鈣粘蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子等。也有觀點(diǎn)認(rèn)為EZH2可參與潛在轉(zhuǎn)移源頭“腫瘤干細(xì)胞”的自我更新[17]。對(duì)卵巢癌的研究則表明EZH2與順鉑耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[18]。目前，EZH2基因在癌變過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不十分清楚。目前關(guān)于EZH2抑制劑的研究仍在進(jìn)行中，尚無(wú)成熟的EZH2抑制劑進(jìn)入臨床前期試驗(yàn)。

1.2 PARP-1 PARP超家族主要在堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER）過(guò)程發(fā)揮重要作用，17個(gè)家族成員中以可以生成活性形式聚腺苷二磷酸核糖［poly（ADP-ribose）, PAR］的PARP-1、PARP-2、PARP5A、PARP5B研究較為深入透徹[19]，被認(rèn)為是潛在的腫瘤生物治療靶點(diǎn)。PARP-1是此家族中結(jié)構(gòu)最典型、最為重要的一個(gè)異構(gòu)體，是在DNA受損時(shí)最早出現(xiàn)并起主要修復(fù)作用的蛋白質(zhì)之一[20,21]。

PARP-1以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸為底物，生成PAR，后者可使RNA聚合酶、DNA聚合酶等多種DNA修復(fù)蛋白發(fā)生聚ADP核糖基化，顯著增強(qiáng)其DNA修復(fù)能力，使整個(gè)DNA修復(fù)過(guò)程順利完成。BER是DNA發(fā)生DNA單鏈斷裂（single strand breaks, SSBs）時(shí)的主要修復(fù)途徑，SSBs若得不到及時(shí)修復(fù)，可逐漸累積進(jìn)展至更為嚴(yán)重的DNA雙鏈斷裂（double stand breaks, DSBs），后者修復(fù)主要依賴同源重組（homologous recombination,HR）和非同源性末端接合（non-homologous end joining,NHEJ）2種途徑。抑癌基因BRCA是HR途徑中的主要成員。PARP-1亦可通過(guò)HR及NHEJ途徑參與DSBs修復(fù)。故在BRCA基因突變患者中，BER途徑的DNA修復(fù)作用尤其必不可少。而反過(guò)來(lái)根據(jù)生物體內(nèi)的“合成致死現(xiàn)象”（synthetic lethality），在BRAC功能缺失情況下抑制腫瘤細(xì)胞PARP基因的表達(dá)，DNA損傷將無(wú)法得到有效修復(fù)從而導(dǎo)致死亡。

Byers等[6]對(duì)135例肺癌標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化分析，結(jié)果顯示PARP-1在SCLC中的表達(dá)水平顯著高于腺癌及鱗癌。體外試驗(yàn)中，NSCLC細(xì)胞系對(duì)PARP-1抑制劑均表現(xiàn)出了不同程度的抵抗性，然而，絕大多數(shù)SCLC細(xì)胞對(duì)PARP-1抑制劑如AZD2281、AG014699則較敏感。可能的機(jī)制是，SCLC作為一種乏氧腫瘤，其慢性缺氧環(huán)境可刺激E2F/p130結(jié)合抑癌基因BRCA1和RAD5啟動(dòng)子位點(diǎn)，導(dǎo)致BRCA1和RAD51表達(dá)水平下調(diào)。BRCA、PARP介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑均被抑制，最終引起SCLC細(xì)胞凋亡[22]。在放療或化療誘導(dǎo)出現(xiàn)癌細(xì)胞SSBs損傷時(shí)，PARP抑制劑通過(guò)抑制DNA修復(fù)作用可進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感度。

目前，多種PARP抑制劑如rucaparib、niraparib、olaparib已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。針對(duì)SCLC的BMN673、viliparib已完成I期臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。值得注意的是，Cardnell等[23]進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)伴有PI3K途徑激活的SCLC細(xì)胞系往往對(duì)PARP抑制劑耐藥。Juvekar等[24]在乳腺癌小鼠模型中觀察到，聯(lián)合應(yīng)用PI3K抑制劑NVP-BKM120與PRAP抑制劑olaparib可延長(zhǎng)腫瘤倍增時(shí)間達(dá)70 d以上，數(shù)倍于單用NVP-BKM120或olaparib的延長(zhǎng)時(shí)間。上述研究結(jié)果提示，在SCLC治療中，可嘗試聯(lián)用PI3K抑制劑與PRAP抑制劑，以改善PARP抑制劑敏感性，增強(qiáng)治療效果。

2 其他傳統(tǒng)驅(qū)動(dòng)基因

2.1 P13K-AKT-mToR信號(hào)傳遞通路 P13K-AKT-mToR途徑為EGFR、HER2等RTKs主要下游信號(hào)傳遞通路之一，該通路異常激活能夠加速腫瘤細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，以及增加化療藥物耐藥性。SCLC是最早報(bào)道存在該通路異常的眾多腫瘤之一。

2.1.1 PTENPTEN是抑癌基因，位于人染色體10q23位點(diǎn)上，負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K下游AKt/mToR信號(hào)通路的活性。有研究[25]顯示，大約15%的SCLC中存在PTEN基因突變，突變后的PTEN基因功能喪失，可引起第二信使PIP3的大量聚集，使得下游通路被激活，從而促進(jìn)腫瘤的形成。

2.1.2 PIK3CA 負(fù)責(zé)編碼PI3Ks家族的催化亞單位p110a，在腫瘤細(xì)胞中，p110a主要作用為上調(diào)Akt的表達(dá)水平，并通過(guò)磷酸化多種底物，包括凋亡相關(guān)蛋白、mTOR組成成分等，促進(jìn)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和增殖。日本學(xué)者擴(kuò)大了基因突變篩查范圍后，在SCLC細(xì)胞株及SCLC病理標(biāo)本中分別發(fā)現(xiàn)23%、13%的PIK3CA基因突變[26]。目前已知PI3K抑制劑如wortmannin和LY294002對(duì)攜帶PIK3CA突變的SCLC細(xì)胞有效[27]。問(wèn)題是目前上述抑制劑均未表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)陌邢蛱禺愋裕瑵撛诙靖弊饔幂^大。

2.1.3 mTOR mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（plosphatidylinositol 3-kinase-related kinase, PIKK）蛋白家族的一員，活化的mTOR基因使蛋白翻譯過(guò)程中的某些因子（最主要是4EBP1和P70S6K）發(fā)生磷酸化，進(jìn)而參與多項(xiàng)細(xì)胞功能。據(jù)報(bào)道，S6K1和S6K2在SCLC細(xì)胞系中可過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。由于其各自的活化不依賴PI3K，于是可被特異性mTOR抑制劑阻斷[28]。mTOR抑制劑依維莫司聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)EP方案一線治療轉(zhuǎn)移性SCLC正在研究中。

2.2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1（fibroblast growth factor receptor-1, FGFR1）擴(kuò)增 FGFR1由位于染色體8p12上的獨(dú)立基因編碼。其與配體FGFs結(jié)合后，主要通過(guò)激活下游RAS/RAf/MEK/Erk、PI3K/Akt信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、血管生成等重要過(guò)程。FGR-FGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常在多種腫瘤的生長(zhǎng)、移行和血管生成過(guò)程中起核心作用。

據(jù)報(bào)道[29]，大約20%肺鱗癌中存在FGFR1基因擴(kuò)增，以FGFR1為靶點(diǎn)的分子藥物治療已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并在肺鱗癌患者中取得一定療效。Schultheis等[30]應(yīng)用熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization, FISH）法檢測(cè)251份SCLC腫瘤組織，證實(shí)約5.6%的SCLC也存在高水平FGFR1擴(kuò)增，但與肺鱗癌擴(kuò)增形式有顯著不同，主要為同源性擴(kuò)增，且均勻分布于腫瘤細(xì)胞，無(wú)肺鱗癌中的“分布熱點(diǎn)”現(xiàn)象。Ruotsalainen等[31]在剛確診SCLC患者的血清中發(fā)現(xiàn)存在高水平FGF-2，既往研究證明FGF-2與腫瘤血管生長(zhǎng)豐富及預(yù)后不良密切相關(guān)。Pardo等[32]研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可作為SCLC細(xì)胞的促分離原，并誘導(dǎo)凋亡蛋白抑制因子Bcl-XL、XIAP表達(dá)，逃避依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。FGF/FGFRs抑制劑在SCLC中的有效性值得進(jìn)一步研究。

2.3SOX2擴(kuò)增 SOX轉(zhuǎn)錄因子家族主要參與調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞分化，也是肺發(fā)育過(guò)程中的一類重要功能調(diào)節(jié)因子。SOX2突變與FGFR1突變一樣，在肺鱗癌多見(jiàn)。SOX擴(kuò)增在SCLC中占27%，Titulaer等[33]應(yīng)用shRNA沉默SOX2表達(dá)后存在SOX2擴(kuò)增的SCLC細(xì)胞系明顯生長(zhǎng)受抑。

2.4MYC擴(kuò)增 原癌基因MYC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有刺激細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡雙重作用，與惡性腫瘤形成、發(fā)展有密切關(guān)系。L-MYC、N-MYC、C-MYC異常擴(kuò)增在肺癌中較明確，其中L-MYC、N-MYC在SCLC中更多見(jiàn)。有研究[34]顯示SCLC中MYC擴(kuò)增一般伴有抑癌基因MAX（MYC-associated factor X gene）、BRG1基因的失活，而并未在NSCLC中觀察到此現(xiàn)象。研究顯示MYC突變可能發(fā)生在癌變過(guò)程的啟動(dòng)階段。

2.5 EGFR EGFR屬于I酪氨酸激酶型受體，激活后觸發(fā)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移、粘附、血管形成等一系列下游事件。除已知肺鱗癌和肺腺癌中存在EGFR過(guò)度表達(dá)，也有證據(jù)表明在SCLC中存在低水平的EGFR突變，且存在EGFR突變的SCLC細(xì)胞系表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性。EGFR突變陽(yáng)性率水平與其對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）類藥物的敏感性并不是完全平行的。體外試驗(yàn)中SCLC細(xì)胞系對(duì)吉非替尼表現(xiàn)出一定敏感性。但之后的II期臨床試驗(yàn)并未觀察到有效反應(yīng)。有個(gè)例報(bào)道TKI類藥物在廣泛期SCLC有一定臨床效果。

2.6 c-Kit 人類c-Kit原癌基因位于人染色體4qll-12位點(diǎn)上，其mRNA長(zhǎng)約5,084 bp，其中2,928 bp編碼蛋白產(chǎn)物，即為c-Kit受體（CD117）。該受體為III型酪氨酸激酶受體，與配體干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF）結(jié)合，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括P13K通路、JAK-STAT通路、MAPK通路等，促進(jìn)各類細(xì)胞的增殖、遷移和分化[35]。

L’opez-Martin等[36]利用免疫組化方法分析204例SCLC標(biāo)本，結(jié)果顯示73%（n=149）有c-Kit表達(dá)。在離體實(shí)驗(yàn)中，c-Kit陽(yáng)性SCLC細(xì)胞系接觸到SCF后瘤細(xì)胞可出現(xiàn)迅速增殖及轉(zhuǎn)移，抑制c-Kit受體后SCLC腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)則明顯受限[37,38]。但在進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)中，c-Kit抑制劑如伊馬替尼卻未能在SCLC患者中顯示抗腫瘤活性。

2.7 c-Met c-Met屬于II型酪氨酸激酶受體，配體為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（human hepatocyte growth factor, HGF）。c-Met/HGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化后可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、分化及血管形成，對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要促進(jìn)作用。c-Met高表達(dá)在多種惡性腫瘤中已有報(bào)道，在各型肺癌中以SCLC多見(jiàn)。Wang等[39]運(yùn)用siRNA下調(diào)c-Met表達(dá)后發(fā)現(xiàn)SCLC細(xì)胞增殖性以及侵襲性均明顯受抑制，表明c-Met/HGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常在SCLC的形成及進(jìn)展中起重要作用。多種c-MET抑制劑如AMG102聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)EP方案（依托泊苷+順鉑）治療轉(zhuǎn)移性SCLC的臨床研究正在進(jìn)行中。

SCLC中已知許多致癌基因突變及分子改變，早期進(jìn)行的針對(duì)其特異性靶點(diǎn)分子靶向治療藥物，如VEGFR抑制劑、bcl-2反義寡核苷酸、IGF-IR抑制劑等，在進(jìn)行的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中并沒(méi)有明顯改變本病的進(jìn)程。最新研究表明EZH2、PARP-1在SCLC中存在明顯高表達(dá)現(xiàn)象，特異性優(yōu)于其他分子治療靶點(diǎn)，有望由此在SCLC靶向治療方面獲得新的突破。但是，目前以EZH2、PARP-1為靶點(diǎn)的分子靶向治療在SCLC中開(kāi)展的研究性試驗(yàn)還十分有限，EZH2、PARP-1具體的致癌分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，相應(yīng)藥物的研發(fā)及其在SCLC治療中的敏感性及安全性問(wèn)題更需要未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間逐步逐層論證落實(shí)。此外，在一些SCLC發(fā)生發(fā)展中可能存在數(shù)個(gè)驅(qū)動(dòng)基因或信號(hào)通路同時(shí)異?；罨?，各自通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤形成，也許是單一分子靶向治療效果不佳原因之一?？偠灾壳叭匀恍枰獙?duì)SCLC驅(qū)動(dòng)基因及具體分子作用機(jī)制不斷深入研究，以指導(dǎo)臨床優(yōu)化治療策略。