拓?fù)涮婵祵?duì)食管癌EC9706細(xì)胞自噬和凋亡的影響

趙　佳　李向楠　朱登彥　吳　愷　丁　政　盛銀良　喬呈瑞　楊　洋　劉東雷　趙　松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南　鄭州　450052)

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拓?fù)涮婵祵?duì)食管癌EC9706細(xì)胞自噬和凋亡的影響

趙佳李向楠朱登彥吳愷丁政盛銀良喬呈瑞楊洋劉東雷趙松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討拓?fù)涮婵?TPT)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株(EC9706)自噬和凋亡的影響。方法使用20 mg/L TPT和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理人食管鱗癌細(xì)胞EC9706，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)TPT對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，單丹磺酰尸胺(MDC)法檢測(cè)TPT對(duì)EC9706細(xì)胞自噬水平的影響，采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)TPT對(duì)EC9706細(xì)胞凋亡的影響，Western 印跡測(cè)定TPT對(duì)EC9706細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)的影響。結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，TPT作用于EC9706細(xì)胞48 h后，TPT組、3-MA組及TPT+3-MA組細(xì)胞凋亡結(jié)率分別為(32.45±2.79)%、(7.58±1.12)%及(48.69±3.51)%。MDC染色結(jié)果顯示TPT能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的出現(xiàn)，而3-MA能顯著抑制這一現(xiàn)象。Western 印跡結(jié)果顯示對(duì)照組、TPT組、3-MA組及TPT+3-MA組Beclin1和Caspase-3蛋白的相對(duì)灰度值分別為0.62±0.06、0.91±0.12、0.47±0.04、1.04±0.08和0.54±0.05、0.84±0.11、0.42±0.03、0.71±0.07。結(jié)論TPT康可以誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生，而3-MA能夠通過(guò)抑制自噬上調(diào)Caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷作用。

關(guān)鍵詞〔〕拓?fù)涮婵?；食管癌；凋亡；自?/p>

第一作者：趙佳(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸外科基礎(chǔ)與臨床研究。

拓?fù)涮婵?TPT)屬于喜樹(shù)堿類化合物，主要通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活動(dòng)，通過(guò)抑制DNA復(fù)制而起到抗癌的作用〔1〕，現(xiàn)多用于肺癌及晚期卵巢癌的化療。研究表明TPT作為放療增敏劑在肺癌、頭頸部腫瘤及食管癌的治療中有效〔2〕，但其對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不完全清楚。本研究主要觀察TPT對(duì)于體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞株(EC9706)細(xì)胞自噬和凋亡的影響，并進(jìn)一步明確自噬和凋亡在其中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料TPT康購(gòu)自貴州漢方制藥有限公司，人食管鱗癌細(xì)胞株EC9706由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、單丹磺酰尸胺(MDC)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Beclin1及Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組EC9706細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～ 3 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、TPT組(20 mg/L)、3-MA組(5 mmol/L)及聯(lián)合應(yīng)用組TPT(20 mg/L)+3-MA(5 mmol/L)組。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔1×106/L細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h；分別加入一系列濃度的3-MA及TPT，每孔加入100 μl，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，放入37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 μl，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=〔1-實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490〕×100%。

1.4AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×107/L的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)濃度藥物， 胰酶消化并離心收集細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，先加入AnnexinV-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI， 立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬水平變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×107/L接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加入相應(yīng)濃度的TPT和(或)3-MA，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，棄培養(yǎng)液，加入濃度為50 μmol/L的MDC在37℃下染色60 min，棄染液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡的變化情況并攝片。

1.5Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞Beclin1和Caspase-3蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106/孔細(xì)胞密度接種，待細(xì)胞貼壁后，按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)濃度加入相應(yīng)藥物，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。提取各組細(xì)胞總蛋白，使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉常溫封閉1 h，分別加入Beclin1及Caspase-3抗體，4 ℃孵育過(guò)夜,后加入二抗，輕輕振搖2 h后洗二抗，并進(jìn)行顯影、定影、洗片。后將結(jié)果掃描后進(jìn)行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1MTT檢測(cè)結(jié)果EC9706細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著TPT和3-MA濃度的增加而逐漸增加。作用48 h后，TPT的IC50為20 mg/L，3-MA的IC10為5 mmol/L，因此將這兩個(gè)濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、3-MA組、TPT組及TPT+3-MA組細(xì)胞凋亡結(jié)率分別為(3.41±0.47)%、(7.58±1.12)%、(32.45±2.79)%、(48.69±3.51)%。與對(duì)照組相比，3-MA組明顯高于空白對(duì)照組；與TPT組相比，TPT+3-MA組細(xì)胞凋亡率明顯高于單用TPT組。

2.3MDC檢測(cè)細(xì)胞自噬細(xì)胞內(nèi)自噬空泡可被染成綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，3-MA組細(xì)胞未見(jiàn)明顯自噬空泡，單用TPT組細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬空泡。與TPT組相比，3-MA+TPT組綠色熒光強(qiáng)度明顯減少。

2.4Western 印跡檢測(cè)細(xì)胞Beclin1和Caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組相比，TPT組Caspase-3和Beclin1蛋白表達(dá)均明顯增加；與TPT組相比，TPT與3-MA聯(lián)合作用組Caspase-3蛋白明顯增加，Beclin1蛋白表達(dá)有所減少，見(jiàn)表1。

表1　各組細(xì)胞中Beclin1和Caspase-3表達(dá)

與對(duì)照組相比:1)P<0.05；與TPT組相比:2)P<0.05

3討論

食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，目前食管癌的治療仍是以手術(shù)、放療和化療為主的聯(lián)合治療。盡管近年來(lái)化療在局部晚期的食管癌治療中起到越來(lái)越重要的作用，但其效果仍不令人滿意。TPT主要通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性，使DNA單鏈斷裂進(jìn)而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。已有研究顯示，TPT康能夠在多種人腫瘤細(xì)胞中起到放射增敏作用，如肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、食管癌等。本研究結(jié)果顯示，TPT能夠?qū)w外生長(zhǎng)的食管鱗癌EC9706細(xì)胞起到明顯的殺傷作用，且這一作用呈時(shí)間-劑量依賴性。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)一種保守的蛋白降解通路，研究顯示其與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化及死亡關(guān)系密切，并與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)〔3〕。Beclin1是酵母ATG6的同系物，是反映細(xì)胞內(nèi)自噬水平高低的標(biāo)志性分子之一，在細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體形成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔4〕。在本研究中，MDC染色結(jié)果顯示TPT能夠在誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時(shí)亦導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬水平的增加，而自噬特異性抑制劑3-MA能夠抑制自噬水平的提高。

為了進(jìn)一步明確自噬和凋亡在TPT對(duì)EC9706細(xì)胞抑制過(guò)程中的作用，我們將自噬特異性抑制劑3-MA與TPT聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示3-MA能夠增加TPT對(duì)EC9706細(xì)胞的殺傷作用，MDC染色及Western 印跡結(jié)果提示這一作用可能與3-MA抑制細(xì)胞內(nèi)自噬水平有關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示，3-MA與TPT聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞凋亡率明顯升高，Western 印跡結(jié)果顯示其機(jī)制可能與Caspase-3蛋白的激活有關(guān)。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成員，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終均需要Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔5〕。本研究結(jié)果提示，在TPT誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中，自噬可能起到保護(hù)作用，抑制自噬可能能夠通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡通路而增加細(xì)胞凋亡。

綜上所述，結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為T(mén)PT能夠?qū)θ薊C9706細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，而聯(lián)合自噬抑制劑有可能增加拓TPT的治療效果，這些發(fā)現(xiàn)為下一步TPT的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)4

1Chen AY,Chen PM,Chen YJ.DNA topoisomerase I drugs and radiotherapy for lung cancer〔J〕.J Thorac Dis，2012;4(4):390-7.

2Owonikoko TK,Aisner J,Wang XV,etal.E5501:phase Ⅱ study of topotecan sequenced with etoposide/cisplatin,and irinotecan/cisplatin sequenced with etoposide for extensive-stage small-cell lung cancer〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2014;73(1):171-80.

3潘麗紅,趙松,黨麗峰，等.自噬在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的食管鱗癌細(xì)胞死亡中的作用〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(11):2339-41.

4Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammation and immunity〔J〕.Nat Rev Immunol，2013;13(10):722-37.

5Yamaguchi M.The anti-apoptotic effect of regucalcin is mediated through multisignaling pathways〔J〕.Apoptosis，2013;18(10):1145-53.

〔2015-09-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：趙松(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事胸部腫瘤的基礎(chǔ)及臨床診治研究。

中圖分類號(hào)〔〕R735.1〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6061-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.024