不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能及多元醇代謝通絡(luò)的影響

賁　瑩　張鳳華　張　冬　方　倩　杜澍金

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北　石家莊　050091)

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不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能及多元醇代謝通絡(luò)的影響

賁瑩張鳳華張冬方倩杜澍金

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北石家莊050091)

摘要〔〕目的探討不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠周圍神經(jīng)功能及多元醇代謝通路的影響。方法采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射誘導(dǎo)建立 SD 大鼠DPN模型，并隨機(jī)分為模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組，每組10只。黃芪60 g組和黃芪120 g組分別用含對應(yīng)量黃芪的補(bǔ)陽還五湯濃煎劑灌胃，甲鈷胺組用175 μg·kg-1·d-1甲鈷胺灌胃。另設(shè)正常組10只。給藥12 w后，檢測空腹血糖(FBG)、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，醛糖還原酶(AR)和Na+-K+-ATP酶活性及山梨醇、肌醇、果糖等多元醇含量。結(jié)果與模型組比較，黃芪120 g組和甲鈷胺組MCV明顯提高(P<0.05)；黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組SCV、肌醇含量顯著提高(P<0.05)，其中黃芪120 g組增高更明顯(P<0.01)；AR活性、果糖含量明顯下降(P<0.05)，黃芪120 g組降低更顯著(P<0.01)。黃芪120 g組山梨醇含量較模型組顯著下降(P<0.01)，Na+-K+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)。黃芪120 g組山梨醇及果糖含量較黃芪60 g組下降(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)陽還五湯能有效抑制 DPN 大鼠的多元醇代謝通路，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，以120 g黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯的抗氧化作用為佳。

關(guān)鍵詞〔〕糖尿病周圍神經(jīng)病變；多元醇代謝通路；補(bǔ)陽還五湯；黃芪

第一作者：賁瑩(1979-)，女，講師，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)研究。

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率較高，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但大量研究表明多元醇通路的激活是引發(fā)DPN的重要因素之一。中醫(yī)認(rèn)為本病主要為絡(luò)氣虛滯，淤血阻絡(luò)，臨床治法上應(yīng)用補(bǔ)氣活血通絡(luò)的補(bǔ)陽還五湯加減治療取得了較好的療效。但對其能否通過抑制多元醇通路代謝而減少周圍神經(jīng)損傷，還缺少客觀實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究探討補(bǔ)陽還五湯對DPN大鼠周圍神經(jīng)功能和多元醇代謝通絡(luò)的影響，并觀察不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯的療效，以期明確補(bǔ)陽還五湯方發(fā)揮治療作用的途徑、效果及方中黃芪的最佳劑量。

1材料與方法

1.1動物試劑與藥物雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g(2月齡左右)，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(冀)2003-1-003。鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司；補(bǔ)陽還五湯原方來源《醫(yī)林改錯(cuò)》，黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，簡稱黃芪120 g組。另設(shè)黃芪60 g，其余藥物劑量不變，簡稱為黃芪60 g組。以上兩組藥物分別加水浸泡2 h，水煎2次，每次40 min，先后兩次藥液合并、濃縮，分別制成含生藥2.4、1.36 g/ml的藥液。甲鈷胺(彌可保)，日本衛(wèi)材株式會社，批號：0006715；Na+，K+-ATP酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2儀器One touch Ⅱ型血糖儀(美強(qiáng)生公司)；DANTEC Cantata肌電圖誘發(fā)電位儀；MPF-4型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；GC6890氣相色譜分析儀(美國安捷倫公司)。

1.3方法

1.3.1分組、建立動物模型50只SD大鼠按體重相似隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、甲鈷胺組，每組10只。在禁食12 h后模型組、黃芪60 g組、黃芪120 g組、甲鈷胺組大鼠給予一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg，72 h后大鼠禁食8 h測鼠尾靜脈血測血糖≥16.7 mmol/L確立為糖尿病大鼠模型，正常組大鼠注射等量的檸檬酸緩沖液。

1.3.2給藥給藥造模成功立即開始灌胃，黃芪60 g組、黃芪120 g組按10 ml·kg-1·d-1分別用相應(yīng)黃芪量藥液灌胃；甲鈷胺組按175 μg·kg-1·d-1甲鈷胺灌胃；正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間自由飲食，連續(xù)給藥12 w。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定給藥結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，用肌電圖儀檢測大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。第一刺激部位在坐骨窩，第二刺激部位在踝部。均用2個(gè)針電極經(jīng)皮插入，電極間距在2 mm，接地于尾部，保持皮溫 30℃。①運(yùn)動神經(jīng)性傳導(dǎo)速度(MCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脈波寬) 刺激神經(jīng)，用2個(gè)針電極在同側(cè)的足部骨間肌記錄復(fù)合肌肉動作電位。記錄3對不同M波的潛伏期，取平均值，兩個(gè)刺激部位間的傳導(dǎo)時(shí)間為近端和遠(yuǎn)端潛伏期差，用彎角規(guī)測量兩個(gè)刺激部位間的距離。MCV(m/s)=距離/潛伏期差值。②感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SCV)：用方形波(10～20 mA，40 μs脈波寬)記錄6對在坐骨窩和踝激發(fā)的H反射潛伏期，用彎角規(guī)測量兩個(gè)刺激部位間的距離。SCV(m/s)=距離/潛伏期差值。

1.4.2醛糖還原酶(AR)活性測定實(shí)驗(yàn)12 w后取大鼠坐骨神經(jīng)，冷生理鹽水沖洗、稱重后，加入1.5 ml的冷生理鹽水勻漿，離心，所得上清為坐骨神經(jīng)勻漿液?？捡R斯亮藍(lán)法測定勻漿液的蛋白含量。參照文獻(xiàn)的方法檢測坐骨神經(jīng) AR 活性〔1〕。

1.4.3多元醇含量的測定取坐骨神經(jīng)勻漿液0.4 ml，加入10%三氯醋酸0.1 ml，振蕩10 s，靜置2 min，離心15 min，取上清液0.3 ml，減壓蒸干。加鹽酸羥胺10 mg，吡啶0.5 ml，90℃加熱15 min，不斷振蕩。取出冷卻至室溫。加入醋酐0.5 ml，90℃水浴反應(yīng)20 min，取出，90℃水浴減壓濃縮至干。加入0.5 ml氯仿，溶解，采用毛細(xì)管柱氣相色譜法分離測定樣品中山梨醇、肌醇、果糖含量，并折算為勻漿中每1 mg蛋白中所含測定物的量。測定樣本中各加入0.25 mg 6，7-二甲氧基香豆素作為內(nèi)標(biāo)。色譜條件：毛細(xì)管柱：HP-5(0.32 mm×30 m)；載氣：氮?dú)?；流速?.5 ml/min；初始溫度：160℃；最高溫度：320℃；檢測器：氫火焰檢測器；進(jìn)樣量：0.4 μl。

1.4.4Na+-K+-ATP酶活性測定采用購自南京建成生物工程研究所的Na+-K+-ATP酶活性測定試劑盒，嚴(yán)格依照說明進(jìn)行操作，測定并計(jì)算坐骨神經(jīng)勻漿液中的Na+-K+-ATP酶活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0軟件，行方差分析和SNK法兩兩比較。

2結(jié)果

2.1FBG變化模型組、黃芪120 g組、黃芪60 g組、甲鈷胺組FBG顯著高于正常組(P<0.05)。黃芪120 g組FBG略低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的比較與正常組比較，模型組坐骨神經(jīng)MCV和SCV明顯減慢(P<0.01)；與模型組比較，黃芪120 g組和甲鈷胺組MCV明顯提高(P<0.05)；黃芪60 g組、黃芪120 g組和甲鈷胺組SCV顯著提高，其中黃芪120 g組SCV增高更明顯(P<0.01)；三藥物干預(yù)組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組坐骨神經(jīng)AR活性比較模型組比正常組AR活性均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪60 g組、黃芪120 g組及甲鈷胺組AR活性降低(P<0.05，P<0.01)，三藥物干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組坐骨神經(jīng)多元醇含量比較模型組比正常組山梨醇、果糖含量顯著升高，肌醇含量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，黃芪120 g組山梨醇含量顯著下降(P<0.01)，黃芪60 g組、黃芪120 g組及甲鈷胺組肌醇含量升高，果糖含量降低(P<0.05，P<0.01)，黃芪120 g組山梨醇及果糖含量較黃芪60 g組下降(P<0.05)。見表2。

2.5各組坐骨神經(jīng)Na+-K+-ATP酶活性比較模型組比正常組Na+-K+-ATP酶活性顯著降低。黃芪120 g組Na+-K+-ATP酶活性較模型組顯著升高(P<0.05)。三藥物干預(yù)組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別FBG(mmol/L)4w8w12wMCV(m/s)SCV(m/s)正常組4.96±0.631)5.02±0.581)4.87±0.511)45.26±4.351)46.45±7.121)模型組26.54±3.7725.83±4.1426.10±3.8130.17±5.1629.21±9.38黃芪60g組27.21±3.2626.36±3.5225.97±2.7234.82±6.3637.06±6.742)黃芪120g組26.25±3.8925.74±3.1624.16±3.0537.36±6.222)40.17±5.251)甲鈷胺組27.12±4.7627.03±3.8526.68±3.7236.30±7.122)38.14±6.862)

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

組別AR活性(U/mgprot)多元醇含量(μg/mgprot)山梨醇肌醇果糖Na+-K+-ATP酶活性(μmolPi·mg-1·h-1)正常組11.21±3.851)126.59±27.331)24.17±5.681)112.58±24.751)0.79±0.081)模型組17.86±4.54219.43±42.8016.36±3.20197.84±41.110.27±0.21黃芪60g組13.73±4.472)192.25±44.0119.28±4.342)160.73±34.972)0.41±0.27黃芪120g組12.23±4.061)154.56±33.981)3)20.65±3.041)128.36±32.811)3)0.62±0.412)甲鈷胺組13.42±3.832)184.35±45.2719.74±3.352)156.75±39.182)0.46±0.38

與模型組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與黃芪60 g組比較：3)P<0.05

3討論

DPN是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，一般認(rèn)為與多元醇通路、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑的激活和糖基化終產(chǎn)物的形成、微血管病變、氧化應(yīng)激反應(yīng)等諸多因素有關(guān)〔2，3〕。多元醇通路代謝增強(qiáng)是引發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要因素。AR是此途徑中的第一個(gè)酶，亦被認(rèn)為是引發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病的關(guān)鍵因素〔4〕。組織中葡萄糖大量增加時(shí)，AR被激活，葡萄糖被大量轉(zhuǎn)化為山梨醇，后者還可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖。山梨醇及果糖等多元醇含量增多導(dǎo)致胞內(nèi)產(chǎn)生高滲狀態(tài)；為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其他滲透物將會減少，如肌醇(在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用)、?；撬?重要的抗氧化劑)等〔5〕。而肌醇的減少又影響蛋白激酶C和鈣調(diào)節(jié)蛋白的活性，導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶活性下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損，進(jìn)而引起周圍神經(jīng)髓鞘分離、脫失，軸索變性以及神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢等改變〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯可使DPN大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度增高，降低體內(nèi)AR活性使山梨醇、果糖含量下降，肌醇含量升高，從而增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活性。此結(jié)果提示補(bǔ)陽還五湯能有效減低DPN大鼠多元醇通路代謝，發(fā)揮其保護(hù)作用。

補(bǔ)陽還五湯為清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，配伍用量特點(diǎn)為君藥黃芪劑量是其他活血通絡(luò)藥總和的5倍，《醫(yī)林改錯(cuò)》中寫到 “黃芪用一二兩，以后漸加至四兩”，重用黃芪旨在令氣旺血行而瘀去絡(luò)通。本結(jié)果中黃芪120 g組山梨醇、果糖含量顯著低于60 g組，說明隨著黃芪劑量的增大，補(bǔ)陽還五湯的神經(jīng)保護(hù)作用愈發(fā)顯著，臨床治療時(shí)推薦按王清任原方120 g黃芪用量使用。

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〔2014-10-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項(xiàng)目：河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2014019)

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7040-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.032