均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化小半夏加茯苓湯效用組分配比實(shí)驗(yàn)研究

陳　倩　楊長(zhǎng)?！№f　佳　何前松　馮　泳貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽(yáng)　550002

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化小半夏加茯苓湯效用組分配比實(shí)驗(yàn)研究

陳倩楊長(zhǎng)福韋佳何前松馮泳1*
貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550002

【摘要】目的:應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化小半夏加茯苓湯效用組分的配比.方法:建立H22荷瘤小鼠模型，將小鼠隨機(jī)分為5組，按照均勻設(shè)計(jì)要求給予不同配比的半夏生物堿、茯苓多糖及姜辣素.連續(xù)給藥10d后，次日處死.運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)方法，以瘤重為療效指標(biāo)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.得到最優(yōu)配比后，另增原方湯劑組、順鉑組、模型組和空白對(duì)照組各一組，將小鼠隨機(jī)分為5組，連續(xù)給藥10d后，次日處死.計(jì)算抑瘤率，檢測(cè)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，對(duì)最優(yōu)配比組方療效進(jìn)行驗(yàn)證.結(jié)果:由均勻設(shè)計(jì)方法得到瘤重回歸方程(y = 0. 556 +0. 06A +2. 091B－0. 271C，r =0. 079)，其中當(dāng)組方中茯苓多糖為0. 005mg、姜辣素為0. 195mg時(shí)瘤重最低.最優(yōu)配比組方可反映原方湯劑的療效，對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)發(fā)揮一定的抑制作用(P＜0. 01);同時(shí)與順鉑組相比，可提高小鼠免疫器官指數(shù)及血清中TNF－α、IL－2的濃度(P＜0. 01).結(jié)論:經(jīng)過(guò)均勻設(shè)計(jì)法確定小半夏加茯苓湯的效用組分用量的優(yōu)化配比，組方體現(xiàn)了一定的腫瘤抑制及免疫調(diào)節(jié)作用，便于對(duì)該方誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行深入研究，有望用于腫瘤放化療的輔助及預(yù)后治療.

【關(guān)鍵詞】小半夏加茯苓湯;半夏生物堿;茯苓多糖;姜辣素;均勻設(shè)計(jì)

小半夏加茯苓湯是中醫(yī)經(jīng)典《金匱要略》中的止嘔名方，臨床配合西醫(yī)學(xué)的化療、放療及藥物的治療，增強(qiáng)抗腫瘤的作用，減輕其他療法的副作用，具有極大的臨床實(shí)用推廣價(jià)值.觀察42例患者，發(fā)現(xiàn)小半夏加茯苓湯治療化療所致嘔吐時(shí)在食欲減退、惡心、嘔吐方面的有效率均高于甲氧氯普胺對(duì)照組，且與甲氧氯普胺有協(xié)同作用[1].本課題組前期觀察小半夏加茯苓顆粒所致家鴿嘔吐次數(shù)，延長(zhǎng)嘔吐潛伏期，使每次發(fā)生嘔吐的頻率降低[2].此外采用血清藥理學(xué)的方法研究小半夏加茯苓顆粒抑制肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌SMMC－7721細(xì)胞具有明顯的抑制作用[3].為了進(jìn)一步明確小半夏加茯苓湯抗腫瘤效用組分及其配伍[4]，本研究選取半夏生物堿、姜辣素、茯苓多糖三種組分，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)，以H22荷瘤小鼠為研究模型，選擇出抑瘤效果最好的組方配比并對(duì)其療效進(jìn)行驗(yàn)證，為該方作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1　實(shí)驗(yàn)材料

1. 1動(dòng)物昆明系小白鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，10～12周齡，(20±2)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究所，動(dòng)物合格證號(hào)43006700001056.

1. 2細(xì)胞株小鼠肝癌22(H22)是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，屬于腹水型細(xì)胞株，懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞活性和形態(tài)優(yōu)異，廣泛應(yīng)用于小鼠腫瘤動(dòng)物模型的復(fù)制.本實(shí)驗(yàn)小鼠肝癌細(xì)胞(H22)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所.

1. 3藥物小半夏加茯苓湯由半夏18g，生姜15g，茯苓9g組成，按照傳統(tǒng)方法水煎(1g生藥/ml)，中藥材半夏購(gòu)于貴州赫章中藥材GAP生產(chǎn)基地，茯苓購(gòu)于貴陽(yáng)濟(jì)仁堂有限公司，生姜市售;順鉑購(gòu)于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(生理鹽水配制為1mg/ml腹腔注射液);半夏生物堿(每克含20克原生藥，批號(hào): RLQC130517)、姜辣素(每克含20克原生藥，批號(hào): RLQC130316)、茯苓多糖(純度為60%以上，批號(hào): RLQC130315－3)購(gòu)于西安瑞林生物科技有限公司;用于動(dòng)物灌胃給藥的藥液由蒸餾水配置.根據(jù)先前預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)[5－7]報(bào)道的有效劑量，分別制定劑量范圍(表1).按均勻設(shè)計(jì)表U5(53)及其使用表進(jìn)行安排，共得5種組分配比方案，將購(gòu)買到的三種組分依據(jù)方案進(jìn)行配制，得到實(shí)驗(yàn)用藥物，其具體配伍見(jiàn)表1.

表1　均勻設(shè)計(jì)表U5(53)

1. 4儀器與試劑CO2培養(yǎng)箱，Napco公司產(chǎn)品;倒置光學(xué)顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品;超凈臺(tái)(型號(hào):天津泰斯特CJ－1D);低溫高速離心機(jī)(型號(hào):長(zhǎng)沙湘儀45171008);分析天平;酶標(biāo)儀(型號(hào): Thermal 1510).

1. 5試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(FBS)(購(gòu)自杭州四季青生物工程材料公司);小鼠IL－2(批號(hào): EM002)、TNF－α ELISA試劑盒(批號(hào): EM008)購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 H22荷瘤小鼠模型制備選用的H22腫瘤瘤株屬小鼠的肝細(xì)胞瘤，無(wú)菌抽取腹部接種H22瘤株7d的種鼠腹水，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為1×107/ml，每只小鼠采用右腋下接種方法進(jìn)行接種相應(yīng)瘤細(xì)胞液0. 1ml.

2. 2分組及用藥

2. 2. 1均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化分組及給藥將昆明系小鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3d后，將100只小鼠按照均勻設(shè)計(jì)要求隨機(jī)分為組方一、組方二、組方三、組方四、組方五5組，每組20只.在腋下接種腹水瘤細(xì)胞液后次日開(kāi)始給藥.組分配比復(fù)方組以0. 2ml/只，用蒸餾水配制為相應(yīng)濃度水溶液灌胃.

各組每日給藥1次，連續(xù)給藥10d.

2. 2. 2最優(yōu)配比驗(yàn)證分組及給藥驗(yàn)效試驗(yàn)將100只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、荷瘤模型組、順鉑組、小半夏加茯苓湯組、最優(yōu)配比組方組(經(jīng)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化得到組方一為最優(yōu)配比組方組)5組，每組20只.空白對(duì)照組和腫瘤模型組每天以0. 2ml生理鹽水灌胃;復(fù)方組以復(fù)方湯劑濃縮液0. 2ml/只灌胃;順鉑組以生理鹽水助溶液0. 1ml/只腹腔注射;組分配比復(fù)方組以蒸餾水配制為相應(yīng)濃度水溶液0. 2ml/只灌胃.各組每日給藥1次，連續(xù)給藥10d.

2. 3瘤重優(yōu)化組分配比配比組方各組連續(xù)給藥10d后，次日將小鼠處死，稱重后剝離腫瘤，稱量瘤重.

2. 4免疫功能調(diào)節(jié)作用檢測(cè)

2. 4. 1抑瘤率及免疫器官指數(shù)驗(yàn)效試驗(yàn)各組小鼠連續(xù)給藥10d后，次日取血后處死小鼠，稱重后剝離腫瘤并摘取胸腺和脾臟，稱瘤重、胸腺重及脾重，計(jì)算并比較各組抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù):抑瘤率(%)=[1－(平均實(shí)驗(yàn)組瘤重/平均對(duì)照組瘤重)]×100%;胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體重(g);脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g).

2. 4. 2外周血IL－2、TNF－α含量測(cè)定各組小鼠末次給藥次日股靜脈取血，室溫靜置1h后離心分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中IL－2、TNF－α的含量，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)A值，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y =(3. 43868－0. 05513)/[1 +(x/831. 80977－1. 24922)]+ 0. 05513(r2= 0. 99989)，y =(10. 73428－0. 14228)/[1 +(x/2622. 80092－1. 04611)]+ 0. 14228(r2= 0. 99992).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算各組IL－2、TNF－α的含量(pg/ml).

2. 5統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20. 0軟件處理數(shù)據(jù)，均勻設(shè)計(jì)方案所得數(shù)據(jù)用進(jìn)入回歸分析;驗(yàn)效所得數(shù)據(jù)用(x±s)表示，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合條件者做方差分析.P＜0. 05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 1小半夏加茯苓湯效用組分的最優(yōu)配比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)入回歸得到瘤重回歸方程y =0. 556 +0. 06A +2. 091B－0. 271C(r = 0. 079).從結(jié)果可知，當(dāng)B(姜辣素)= 0. 005，C(茯苓多糖)=0. 195時(shí)，ymin=0. 514.上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方配比1的瘤重最小.

3. 2對(duì)小鼠H22移植瘤生長(zhǎng)的影響由表2可見(jiàn)，與荷瘤模型組比較，復(fù)方組、順鉑組及最優(yōu)配比組方的瘤重均有所降低(P＜0. 01)，其中順鉑組的抑瘤率最高(P＜0. 01).提示小半夏加茯苓湯及其效用組分組分配伍在腫瘤抑制方面有一定作用.

表2　不同配比的小半夏加茯苓湯對(duì)小鼠H22移植瘤生長(zhǎng)的影響(x±s，n =20)

3. 3對(duì)H22荷瘤小鼠免疫功能的影響由表3可見(jiàn)，復(fù)方組、最優(yōu)配比組方的免疫器官指數(shù)與小鼠血清中TNF－α、IL－2濃度明顯提高，與荷瘤模型組及順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 01).而順鉑組的胸腺指數(shù)與TNF－α濃度，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 01); IL－2濃度與之比較略有降低(P＜0. 05).提示小半夏加茯苓湯及其效用組分配伍與順鉑相比還對(duì)免疫功能有一定的調(diào)節(jié)作用.

表3　不同配比的小半夏加茯苓湯對(duì)H22小鼠免疫功能的影響(x±s，n =20)

4　討論

中草藥質(zhì)量受到氣候、產(chǎn)地、種植工藝、炮制方法等諸多原因限制，相同藥量的中藥有效成分往往差異很大，造成同一方劑有效成分的穩(wěn)定性不夠理想，臨床療效也有較大差異[8].中藥復(fù)方的效用組分配伍是在中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的基礎(chǔ)之上，從臨床有效藥對(duì)及經(jīng)典復(fù)方切入，基于相對(duì)清楚的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理，以整體量效關(guān)系優(yōu)化配比，提取中藥復(fù)方的有效組分進(jìn)行研究.對(duì)各效用組分進(jìn)行配伍、配比兩個(gè)層次的優(yōu)化設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出符合原方配伍規(guī)律及功效的較優(yōu)配比[4].

半夏的主要活性物質(zhì)是生物堿，具有止嘔、鎮(zhèn)咳、祛痰、降壓、降脂以及抗腫瘤作用.能激活迷走神經(jīng)傳出活動(dòng)發(fā)揮鎮(zhèn)吐作用，其效用物質(zhì)主要是生物堿[9].近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)半夏的研究表明其具有確切的抗腫瘤作用，采用MTT比色法、TUNEL技術(shù)與免疫組化SABC染色法，檢測(cè)結(jié)果顯示半夏生物堿對(duì)肝癌細(xì)胞Bel－7402增殖有顯著抑制作用，可誘導(dǎo)Bel－7402細(xì)胞凋亡，使Bax表達(dá)顯著升高而B(niǎo)cl－2表達(dá)顯著下降[10];半夏多糖通過(guò)抑制PC12生長(zhǎng)及增殖，誘導(dǎo)SH2SY5Y、PC12細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤作用[11].

姜辣素是姜生物活性的主要成分[12]，在體內(nèi)外研究中采用蛋白印跡等分子生物學(xué)技術(shù)明確6－姜辣素通過(guò)抑制抗炎因子LTA5H的活性而發(fā)揮直腸癌抑瘤作用[13].此外，姜辣素通過(guò)抑制NF－kB的活性同時(shí)減少VEGF和IL－8的分泌來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞血管生成因子來(lái)抑制其增殖[6].

茯苓多糖是從茯苓中提取的，為目前常用的抗腫瘤藥物.不僅可以提高免疫功能，還能通過(guò)抗自由基、改變瘤

體膜的生長(zhǎng)特性、影響腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及瘤體細(xì)胞蛋白和核酸的合成發(fā)揮細(xì)胞毒作用，還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[7].此外茯苓多糖修飾物通過(guò)增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用[14].

本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取復(fù)方中藥中的主要活性組分，半夏生物堿、姜辣素及茯苓多糖，結(jié)合效用組分配伍，以瘤重為參考，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)，優(yōu)選出了最佳配比.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示效用組分組方還原了復(fù)方本來(lái)的功效，與順鉑組相比，小半夏加茯苓湯及效用組分配伍還可增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能.小半夏加茯苓湯是經(jīng)典的止嘔圣方，現(xiàn)代臨床腫瘤的放化療往往出現(xiàn)嘔吐等副反應(yīng)，配合使用該方可達(dá)到很好的止嘔作用，通過(guò)效用組分配比對(duì)該方的作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)該方還可在腫瘤抑制及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮一定作用，具體作用通路還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究和證實(shí).采用效用組分配伍，對(duì)闡釋復(fù)方作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了簡(jiǎn)便可行的研究方案，為作用機(jī)制研究提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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收稿日期:( 2014. 11. 30)

通信作者:馮泳(1964－)，女，教授，主要從事中藥復(fù)方配伍研究.

作者簡(jiǎn)介:陳倩(1989－)，女，碩士.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160425/H2705).

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)05－0007－03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R285. 5