清脈飲含藥血清對體外TNF－α損傷EAhy－926細(xì)胞的影響

康浩浩1魏　齊1魏彥寧1張偉芳2趙　凱3*1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏　銀川　750004; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)醫(yī)院，寧夏　吳忠　751100;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，寧夏　銀川　750004

清脈飲含藥血清對體外TNF－α損傷EAhy－926細(xì)胞的影響

康浩浩1魏齊1魏彥寧1張偉芳2趙凱3*
1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏銀川750004; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)醫(yī)院，寧夏吳忠751100;
3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，寧夏銀川750004

【摘要】目的:研究清脈飲含藥血清對腫瘤壞死因子α(TNF－α)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Ehay926)的影響.方法:制備含藥血清;將體外培養(yǎng)的EAhy－926細(xì)胞，隨機分為正常對照組、清法組、活血組、全方組、軟堅組、西藥組、TNF－α損傷組等;清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24h后，光學(xué)顯微鏡(下稱光鏡)下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，電子顯微鏡(下稱電鏡)下觀察細(xì)胞的細(xì)胞器改變.結(jié)果:①光鏡下細(xì)胞大體形態(tài)變化:清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理的細(xì)胞，各組損傷均較少，細(xì)胞數(shù)量多，活血組細(xì)胞數(shù)量相對較少;②電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變:清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理的細(xì)胞器損害較單純TNF－α損傷組的細(xì)胞小，其中以中劑清法組、軟堅組、西藥組對細(xì)胞器的損傷最少，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與正常對照組比較沒有明顯差異.結(jié)論:清脈飲含藥血清可一定程度上對TNF－α損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護作用，減少其對細(xì)胞器的損害，且含藥血清對細(xì)胞的保護作用存在血清濃度差異，其機制可能與抑制TNF－α的促炎作用以減少其對細(xì)胞器的損害有關(guān).

【關(guān)鍵詞】清脈飲;含藥血清; TNF－α; EAhy－926

The influence of qing mai yin ontaining serum on VECs injuried by TNF－α

KANG Hao-hao1，WEI Qi，WEI Yan-ning1，ZHANG Wei-fang2，ZHAO Kai3
1. Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China; 2. Ningxia medical university affiliated to the medical hospital of traditional Chinese medicine，Wuzhong 751100，China; 3. Ningxia medical university general hospital，Yinchuan 750004，China

Abstract:Objective To research the influence of Qing Mai Yin medicated serum on human umbilical vein endothelial cells(EA-hy－926)by tumor necrosis factor alpha(TNF alpha)．Methods Preparation of medicated serum; The EAhy－926 cells were incubated in vitro and divided into normal control group，the low dose Qing Fa group，the normal dose Qing Fa group，the high dose Qing Fa group，Huo Xue group，Quan Fang group，Ruan Jian group，medicine group，TNF－α injury group etc．The serum containing medicine and different concentrations of Qing Fa serum containing handle with the TNF－αendothelial cells 24 hours after，morphological changes of EAhy－926 cells were observed under light microscope; cell organelles change of EAhy－926 cells were observed under the electron microscope; Results①The changes in general morphological cells under light microscope compared with TNF－α injury group，the serum containing medicine was significantly increased the cell viability，each group damage less and cell number，cells of Huo Xue group are relatively few;②The changes in the structure cells under electron microscope．The damage compared with TNF－α injury group，the serum containing medicine was significantly pure TNF alpha cells of small injury group．The cell organelles was least damage in Qing Fa group，Ruan Jian group，medicine group and the cell ultrastructure was no significant difference compared with normal control group．Conclusion Qing Mai Yin medicated serum can be a certain level of TNF alpha injury of vascular endothelial cell protection，reduce the damage to the organelles，and serum medicated serum concentration differences of cell protection，its mechanism may be related to inhibition of TNF－α proinflammatory role，reduce the damage to the organelles．

Key words:Qing mai yin; containing serum; TNF－α; EAhy－926

動脈粥樣硬化閉塞癥(Atherosclerotic Occlusion，ASO)是指動脈粥樣硬化(Atherosclerotic，AS)累及周圍動脈并引起慢性閉塞的一種AS相關(guān)疾病.而AS與高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙、年齡、遺傳的關(guān)系已基本確定，近年來證實感染因素亦是誘發(fā)原因之一.此類疾病病程較長、病情較重、病人痛苦、難以根治，嚴(yán)重危害著人類的健康.在對有關(guān)動脈粥樣硬化的發(fā)病機制理論研究中，Ross[1－2]早在1974年提出，Ross教授后來又較系統(tǒng)全面地綜述了多年文獻，以新的論據(jù)在損傷反應(yīng)學(xué)說的基礎(chǔ)上，明確提出“AS是一種炎癥性疾病”，認(rèn)為內(nèi)皮損傷，不論物理損傷還是更細(xì)微的細(xì)胞損害是動脈粥樣硬化中一個重要的早期事件.內(nèi)皮損傷不但是指內(nèi)皮剝脫，還包括內(nèi)皮功能變化及內(nèi)皮功能障礙[3].近年發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能損害是動脈粥樣硬化發(fā)病的首要和最早環(huán)節(jié)，且是導(dǎo)致其不斷進展的重要因素[4]，所以AS的早期防治和開發(fā)新藥成為研究的重點.中藥治療AS相關(guān)疾病臨床療效顯著，并有一定預(yù)防作用，有良好的發(fā)展前景.目前此類研究多集中在活血化瘀方面，從清法藥物對動脈粥樣硬化進行研究的較少.因此，本實驗擬從中醫(yī)不同治法含藥血清對TNF－α損傷的EAhy－926細(xì)胞的影響進行研究，為進一步明確其保護血管內(nèi)皮的可能機制.

1　材料和方法

1. 1試劑、動物腫瘤壞死因子α(批號: 0607B25，美國PEPRO TECH公司); DMEM(Hyclone批號: NZH1209); PBS(Hyclone批號: NZH1195);胎牛血清(Hyclone批號: NZH1439);胰蛋白酶(Hyclone批號: J140028);二甲基亞颯(Sigma批號: BCBH2085V，美國Sigma公司).SD雄性大鼠60只，體重(250±50)g，普通級，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[scxk(寧)2013－0035].

1. 2藥物全方(清脈飲):垂盆草、大黃、昆布、煅牡蠣、丹參、蒲黃、姜黃、夏枯草、茵陳、澤瀉、海藻等;清法組:大黃、垂盆草、夏枯草、昆布等;軟堅組:昆布、煅牡蠣、海藻、夏枯草等;活血組:丹參、蒲黃、姜黃、大黃等;以上中藥均由寧夏古方大藥房提供，各組方藥分別按照傳統(tǒng)中藥煎煮方法，煎煮、濾液，根據(jù)大鼠的體重計算用藥量后，濃縮至需要濃度[5]，用蒸餾水配制.西藥組:辛伐他汀片(批號: 110622，山東羅欣藥業(yè)股份有限公司)10mg/片.

2　實驗方法

2. 1含藥血清的制備

2. 1. 1分組及給藥方法將56只雄性SD大鼠隨機分為八組(即正常對照組、低劑量清法方組、中劑量清法方組、高劑量清法方組、全方組、軟堅方組、活血組、辛伐他汀組)，每組7只.按體型系數(shù)換算法[6]中人鼠等效藥量換算方法計算給藥劑量，全方組16. 9g/(kg· d)，低劑清法方組2. 9g/(kg·d)，中劑清法方組5. 99g/(kg·d)，高劑清法方組12. 21g/(kg·d)，軟堅方組2. 61g/(kg·d)，活血方組1. 7g/(kg·d)(均為生藥量)，辛伐他汀組0. 67mg，給大鼠灌胃，同時以等量生理鹽水灌飼正常對照組，每日一次.

2. 1. 2動物采血及分離血清每天灌胃2次，連續(xù)3d后，當(dāng)夜禁食不禁水，第4d再給藥一次，中藥組在末次給藥后1. 5～2h，西藥組在給藥后1h心臟采血;加蓋靜置2h后，待血液固縮，無菌條件下分離血清，離心(3000r/min，15min);同組混合用0. 22μm的濾器過濾以消除個體差異，再水浴鍋滅活(56℃，30min)，分裝1ml EP管中，－20℃保存?zhèn)溆?

2. 2 TNF－α的溶解及配制①試劑開蓋前，將TNF－α凍干粉離心5min，3000～3500r/min;②用無菌水重懸至0. 1～1. 0mg/ml，用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子完全溶解，不可振蕩，將重懸液靜置于室溫下2h以上;③用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋成20ng/ml，分裝，－20℃保存?zhèn)溆?

2. 3人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EAhy－926)培養(yǎng)細(xì)胞由上海市中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，同時加入100U/ml青霉素和0. 1mg/ml鏈霉素，在37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞;待細(xì)胞生長至近匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁80%以上時，進行傳代;將生長良好的人EAhy－926用0. 25%的胰蛋白酶1ml消化1～3min后，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，每周傳代2～3次;取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后以1× 105/ml，接種于96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于增殖期后分組實驗.

2. 4細(xì)胞的分組及給藥方法取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將其消化，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液以1×105/ml，200μl/孔接種于96孔板或4×105/ml接種于25cm培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁，近乎融合，吸棄培養(yǎng)液，用含0. 2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液靜止24h，使細(xì)胞同步化至G1期，然后隨機分為9組:正常對照組; TNF－α組;低劑清法組;中劑清法組;高劑清法組;全方組;軟堅組;活血組;西藥組.加入TNF－α及各濃度含藥血清，37℃，5%CO2，培養(yǎng)育24h，待測.

2. 5實驗方法

2. 5. 1光鏡觀察細(xì)胞的大體形態(tài)取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后以1×105/ml制備成細(xì)胞懸液，200μl/孔，種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，換用含0. 2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使細(xì)胞同步化，同時加入各濃度不同含藥血清及TNF －α(20ng/ml)的混合液，200μl/孔，孵育24h后，光鏡下觀察細(xì)胞的大體形態(tài)變化[5].

2. 5. 2電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2. 5. 2. 1前固定①取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后種于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，換用含0. 2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使細(xì)胞同步化，同時加入各濃度不同含藥血清及TNF－α(20ng/ml)的混合液孵育24h，用0. 25%胰蛋白酶將其消化，離心800r/min，5min，收集細(xì)胞;②加入固定液1ml，重懸，4℃靜置10 min;③4℃離心800r/min，5min，去上清，盡量除凈;④加入固定液1ml，重懸，4℃靜置30min;⑤4℃離心r/min，5min，去上清;⑥加入0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液1ml，重懸，4℃靜置1h;⑦4℃離心800r/min，5min，去上清;⑧重復(fù)操作步驟⑥兩次、⑦一次;⑨4℃保存，每周換一次0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液.

2. 5. 2. 2后固定①離心800r/min，5 min，去上清;②加入1ml 1%鋨酸，輕混勻，4℃靜置1h;③離心800r/min，5 min，去上清;④加入1ml 0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液，混勻，4℃靜置15min;⑤離心800r/min，5min，去上清;⑥重復(fù)操作步驟④、⑤.

2. 5. 2. 3脫水①依次加入30%、50%、70%冷乙醇，混勻，4℃靜置5 min，離心800 r/min，5 min，去上清;②依次加入80%、90%冷乙醇，混勻，室溫靜置5min，離心800r/min，5min，去上清;③加入100%常溫乙醇，混勻，室溫靜置3min，離心800r/min，5min，去上清;④重復(fù)操作步驟③;⑤加入環(huán)氧丙烷滲透，室溫靜置15h，離心800 r/min，5min，去上清;⑥重復(fù)操作步驟⑤;⑦1∶1不完全包埋液，室溫滲透1h.

2. 5. 2. 4包埋①離心800 r/min，5min，去上清;②將細(xì)胞全部轉(zhuǎn)入膠囊中，加入完全包埋液;③離心800 r/min，5min，使細(xì)胞沉在膠囊底部;④加上標(biāo)簽，35℃溫箱6h; ⑤42℃溫箱6h;⑥60℃溫箱6h.

2. 5. 2. 4切片觀察700及2500倍下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變.

3　結(jié)果

3. 1光鏡下細(xì)胞大體形態(tài)變化正常對照組內(nèi)皮細(xì)胞為單層，數(shù)量多，飽滿，互不重疊，呈鋪石狀鑲嵌排列，邊界清楚; TNF－α損傷組細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞收縮，胞膜皺縮，細(xì)胞邊界不清; TNF－α與含藥血清共同處理的細(xì)胞，各組損傷均較少，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常，活血組細(xì)胞數(shù)量相對較少，見圖1～4.

圖1　光鏡下正常對照組細(xì)胞形態(tài)（100x）

圖2　光鏡下清法組細(xì)胞形態(tài)（100X）

圖3　光鏡下TNF-α損傷組細(xì)胞形態(tài)（100X）

圖4　光鏡下活血組細(xì)胞形態(tài)（100X）

3. 2電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變①體外正常培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞膜完整，連續(xù)，雙層結(jié)構(gòu)，表面可見微絨毛;細(xì)胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)均勻，無固縮;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴張，線粒體未見腫脹.②TNF－α損傷組，內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，胞膜破損，不連續(xù)，欠完整;核膜雙層結(jié)構(gòu)消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;細(xì)胞核固縮、變形，甚至消失，核內(nèi)多個核仁，核染色質(zhì)不均勻、聚集明顯;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的空泡;鏡下見大量壞死的細(xì)胞碎片及凋亡小體.③TNF－α與含藥血清共同處理的內(nèi)皮細(xì)胞，其損害較單純TNF－α損傷組的細(xì)胞小，細(xì)胞膜較連續(xù)完整;細(xì)胞核變形較輕，核染色質(zhì)較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內(nèi)空泡明顯縮小或減少;鏡下很少見壞死細(xì)胞碎片，未見凋亡小體.其中在TNF－α損傷實驗同時加入含藥血清的全方組、高、中、低劑清法組、軟堅組、西藥組較損傷組、活血組對細(xì)胞器的損傷最少，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與正常對照組比較沒有明顯差異(細(xì)胞膜較連續(xù)完整;細(xì)胞核變形較輕，核染色質(zhì)較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內(nèi)空泡明顯縮小或減少).活血組對細(xì)胞器的損傷較多，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷較大(內(nèi)皮細(xì)胞損傷較明顯，胞膜不連續(xù)，欠完整;部分核膜雙層結(jié)構(gòu)消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;部分細(xì)胞核固縮、變形，甚至消失，核內(nèi)多個核仁，核染色質(zhì)不均勻、聚集明顯;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量空泡;鏡下可見少量壞死的細(xì)胞碎片及凋亡小體).10%低劑清法組、10%中劑清法組、10%高劑清法三組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)未見明顯差異.見圖5～22.

圖5　電鏡下正常對照組細(xì)胞形態(tài)（700x）

圖6　電鏡下正常對照組細(xì)胞形態(tài)（2500x）

圖7　電鏡下TNF-α損傷組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖8　電鏡下TNF-α損傷組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖9　電鏡下低清法組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖10　電鏡下低清法組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖11　電鏡下中清法組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖12　電鏡下中清法組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖13　電鏡下高清法組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖14　電鏡下高清法組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖15　電鏡下全方組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖16　電鏡下全方組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖17　電鏡下活血組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖18　電鏡下活血組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖19　電鏡下軟堅組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖20　電鏡下軟堅組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

圖21　電鏡下西藥組細(xì)胞形態(tài)（700X）

圖22　電鏡下西藥組細(xì)胞形態(tài)（2500X）

4　討論

ASO屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽”范疇，多認(rèn)為是由于飲食不節(jié)、臟腑虧虛、外邪侵襲導(dǎo)致濕熱痰濁瘀血互結(jié)，脈絡(luò)閉阻而成.傳統(tǒng)治療往往采用活血祛瘀消痰之法，各項研究也較集中在活血化瘀領(lǐng)域，較易忽視痰瘀皆為邪氣所致，所謂“虛邪賊風(fēng)”總是疾病之起因，而邪被認(rèn)為是導(dǎo)致各種脈管病的致病因子.由全國脈管病泰斗奚九一教授提出的“因邪致瘀”理論，首倡以軟堅清法為主治療ASO，療效滿意[7].趙凱教授在此基礎(chǔ)上提出“毒滯脈絡(luò)”，提出治療ASO法貴清通[8]，臨床運用清脈飲治療動脈硬化相關(guān)疾病取得良好療效.

現(xiàn)代研究表明，在AS的整個發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙不僅是AS的一個始動環(huán)節(jié)，還是導(dǎo)致其不斷進展的重要因素[9].血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機械屏障，也是人體最大、最重要的內(nèi)分泌器官.血管內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激下產(chǎn)生促炎因子，在促炎因子作用下引起內(nèi)皮損傷.因此，在預(yù)防和治療動脈粥樣硬化過程中，預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用研究顯得尤為重要.本研究采用體外培養(yǎng)EAhy－926細(xì)胞細(xì)胞，探討清脈飲含藥血清對TNF－α誘導(dǎo)的EAhy－926細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響.

TNF－α由活化的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成，在細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)中刺激其它細(xì)胞因子的合成，并且參與促進黏附分子的表達、炎癥細(xì)胞的募集和激活，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，還可通過影響脂質(zhì)代謝而促進AS[10－11].當(dāng)TNF－α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷又促進白細(xì)胞介素－1和TNF－α釋放，同時TNF－α對血管內(nèi)皮細(xì)胞再次產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，進一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而形成惡性循環(huán)[12].TNF－α是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，可從多種炎癥細(xì)胞中釋放，在動脈粥樣硬化形成和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用;可抑制一氧化氮合酶的生成、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞的老化及刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達粘附分子，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促使血栓形成[13－14];并且可以刺激炎癥因子的產(chǎn)生，直接發(fā)揮促炎作用[13－15].故在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中TNF－α起著關(guān)鍵的作用[3].TNF－α是通過對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生.因此，抑制TNF －α對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用，改善和恢復(fù)血管內(nèi)皮功能已經(jīng)成為AS防治的重要目標(biāo)之一.

實驗結(jié)果顯示，光鏡下，TNF－α與含藥血清共同處理的細(xì)胞，各組損傷均較少，細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常，活血組細(xì)胞數(shù)量相對較少;電鏡下，全方組、高、中、低劑清法組、軟堅組、西藥組較損傷組、活血組對細(xì)胞器的損傷最少，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與正常對照組比較沒有明顯差異(細(xì)胞膜較連續(xù)完整;細(xì)胞核變形較輕，核染色質(zhì)較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內(nèi)空泡明顯縮小或減少)，而活血組對細(xì)胞器的損傷較多，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷較大(內(nèi)皮細(xì)胞損傷較明顯，胞膜不連續(xù)，欠完整;部分核膜雙層結(jié)構(gòu)消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;部分細(xì)胞核固縮、變形，甚至消失，核內(nèi)多個核仁，核染色質(zhì)不均勻、聚集明顯;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量空泡;鏡下可見少量壞死的細(xì)胞碎片及凋亡小體.).低劑清法組、中劑清法組、高劑清法三組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)未見明顯差異.證實了中醫(yī)不同治法含藥血清對TNF－α損傷的EAhy－926細(xì)胞有一定的保護作用，其機制可能與抑制TNF－α炎癥反應(yīng)有關(guān)，其可能是治療動脈粥樣硬化的作用機制之一.

參考文獻

[1]Ross R，Glomset F，Kariya B，et al．A platelet dependent serum factor that stimulates the proliferation of arterial smooth muscle cells in vitro[J]．Pr Natl Acad Sci USA，1974，71: 1207－1210．

[2]Ross R．Atherosclerosis－an inflammatory disease[J]．N Engl J Med，1999，31(1): 115－126．

[3]喻卓，陳鵬，楊桂梅，等．20(R)－人參皂苷Rg3對腫瘤壞死因子－α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用[J]．嶺南心血管病雜志，2011，17(3): 199．

[4]Olkkonen VW，Lehto M．Oxysterols and oxysterol binding proteins: role in lipid metabolism and atherosclerosis[J]．Ann Med，2004，36(8): 562 －572．

[5]張偉芳，黃鑫，趙凱．清脈飲及其拆方含藥血清對TNF－α損傷的Ealy －926細(xì)胞的保護作用[J]．寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，6(3): 635．

[6]陳奇．中藥藥理實驗方法[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社，1994: 206．[7]王健，奚九一，趙兆琳．軟堅清脈方對肢體動脈硬化性閉塞主證的臨床研究[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2004，10(2): 67．

[8]陳凱偉，錢月慧，黃鑫，等，清脈飲及其拆方對動脈粥樣硬化閉塞癥兔主動脈I－kB及NF－kB mRNA表達的變化的影響[J]．寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，7(3): 720．

[9]繆薇，朱榆紅．動脈粥樣硬化發(fā)病機制和藥物干預(yù)的研究現(xiàn)狀[J]．臨床醫(yī)學(xué)，2009，16(3): 401．

[10]居峰，吳劍，吳文宏，等．高甘油三酯血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用[J]．實驗與研究，2011，8(12): 27．

[11]金惠銘，劉清行，曹翔，等．TNF－α引起的微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及其細(xì)胞分子機制[J]．微循環(huán)學(xué)雜志，2000，10(3): 5．

[12]林蓉，劉俊田，甘偉杰．槲皮素TNF－α損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用[J]．中藥材，2004，27(8): 598．

[13]Kleemann R，ZadelaarS，KooistraT．Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice[J]．Cardiovasc Res，2008，79(3): 360－376．

[14]Zhang H，Park Y，Wu J，et al．Role of TNF－alpha in vascular dysfunction[J]．C lin Sci(Lond)，2009，116(3): 2129－2130．

[15]Popa C，NeteaMG，van Riel PL，et al．The role of TNF alpha in chronic inflammatory conditions，intermediarym etabolism and cardiovascular risk[J]．J Lipid Res，2007，48(4): 751－762．

收稿日期:( 2014. 12. 10)

通信作者:趙凱(1969－)，男(滿族)，北京人，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師.主要從事中西醫(yī)結(jié)合臨床、教學(xué)工作，以及風(fēng)濕性疾病、周圍血管病和內(nèi)分泌代謝性疾病的臨床及基礎(chǔ)研究，E－mail: exkl@163. com

作者簡介:康浩浩(1988－)，男，在讀碩士研究生，主要從事風(fēng)濕性疾病、動脈粥樣硬化的研究.

基金項目:國家自然科學(xué)基金(81160432).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0019－04

【文獻標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R285. 5