藤茶提取物對人前列腺癌LNcap細(xì)胞凋亡作用研究

姚　欣林靜瑜倪　峰張月芬.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建　福州　50; .福建省中醫(yī)藥研究院，福建　福州　5000; .福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建　福州　500

藤茶提取物對人前列腺癌LNcap細(xì)胞凋亡作用研究

姚欣1林靜瑜2倪峰3張月芬3
1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122; 2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州350003; 3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350101

【摘要】目的:研究藤茶提取物對人前列腺癌LNcap細(xì)胞凋亡的作用.方法:用流式Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率.結(jié)果:藤茶提取物對LNcap細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，且有量效關(guān)系.結(jié)論:藤茶提取物可顯著誘導(dǎo)LNcap細(xì)胞凋亡.

【關(guān)鍵詞】藤茶;前列腺癌; LNcap;細(xì)胞凋亡

Research on Apoptosis of LNcap Cells with the Extract of Ampelopsis

YAO Xin1LIN Jing－yu2NI Feng3ZHANG Yue－fen3
1. Fujian University of Trational Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China; 2. Fujian Institute of
Trational Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China; 3. Fujian Health College，F(xiàn)uzhou 350101，China

Abstract:Objective To study the apoptosis effect of LNcap Cells with the extract of Ampelopsis．Method Observing the apoptosis rates of LNcap cells by Annexin V/PI fluorescent staining of Flow Cytometric Method(FCM)．Result The apoptosis rates of LNcap cells rose significantly after 24 hours，with dose－response relationship．Conclusion The extract of Ampelopsis can induse apoptosis of LNcap Cells remarkably．

Key words:Ampelopsis; prostatic cancer; LNcap; Apoptosis

藤茶為葡萄科顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentala(Hand－Mazz)W. T. Wang的莖葉，俗稱甘露茶、白毛猴、甜茶等，在我國廣西、湖南、福建等南方地區(qū)都有豐富的資源.其性涼，味甘淡，具有清熱解毒的功效，民間常用于咽喉腫痛、感冒發(fā)熱等[1].藤茶提取物中黃酮類部位平均含量超過15%，富含蛇葡萄素(3，5，7，3'，4，5'－六羥基－2，3雙氫黃酮醇，AMP)等物質(zhì)，是主要活性部位[2].我們前期研究發(fā)現(xiàn)藤茶提取物對多種人癌細(xì)胞有抑制作用[3－5]，在此基礎(chǔ)上，本文主要以流式Annexin V/PI雙染法觀察其對人前列腺癌LNcap細(xì)胞的凋亡作用.

1　材料和儀器

1. 1藥物藤茶提取物為本實驗室自制[6].

1. 2細(xì)胞株人前列腺癌LNcap細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫.

1. 3試劑1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(美國Hyclone公司);胰酶(美國Gibco公司); Annexin V/PI雙染試劑盒(美國BD公司).

1. 4儀器HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱(美國熱電公司);

BCM－1000超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司); FACSCali

bur流式細(xì)胞儀(美國BD公司); TS－100倒置顯微鏡(日本尼康公司).

圖1　實驗組和對照組LNcap細(xì)胞形態(tài)比較（24h）

2　方法

2. 1細(xì)胞培養(yǎng)將LNcap細(xì)胞置于含10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗.

2. 2細(xì)胞凋亡率測定取對數(shù)期生長的LNcap細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)箱過夜;實驗組加入適當(dāng)濃度的藤茶提取物，使終濃度在25、50μg/ml，對照組加入同體積PBS; 24h后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);分別用胰酶消化各組細(xì)胞，PBS清洗，1500rpm離心5min，收集細(xì)胞;用PBS稀釋細(xì)胞至濃度1×106/ml，于暗處加入Annexin V、PI各5μl，振蕩混勻，室溫避光15min，上流式細(xì)胞儀檢測.

2. 3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18. 0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用(x± s)表示，組間的比較用單因素方差分析，P＜0. 05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

3　實驗結(jié)果

3. 1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察正常LNcap細(xì)胞貼壁生長良好，排列緊密，有透光性.加入藤茶提取物處理后細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞皺縮變圓，部分細(xì)胞懸浮甚至死亡.

3. 2細(xì)胞凋亡率如圖2，橫坐標(biāo)代表Annexin V－FITC的熒光強度，縱坐標(biāo)代表PI熒光強度，均采用對數(shù)坐標(biāo)軸.左下象限為正常細(xì)胞，右上象限為壞死細(xì)胞，右下象限為凋亡細(xì)胞.經(jīng)藤茶提取物處理24h后，凋亡細(xì)胞明顯比對照組多，且有量效依賴關(guān)系(表1).壞死細(xì)胞結(jié)果類似凋亡細(xì)胞./%

圖2　流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

表1　不同劑量藤茶提取物對LNcap細(xì)胞的凋亡作用(x±s，%)

4　討論

據(jù)文獻報道，藤茶提取物對多種人癌細(xì)胞都有很好的抑制作用.但除本課題組外，鮮有見到關(guān)于抗前列腺癌的報道[3－4，7].我們前期研究發(fā)現(xiàn)藤茶提取物在較低濃度下即對LNcap細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并推測凋亡誘導(dǎo)可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的一個途徑.

流式Annexin V/PI雙染法是較為靈敏的細(xì)胞凋亡測定方法，通過Annexin V－FITC和PI雙重?zé)晒鈽?biāo)記以區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞.生長旺盛的LNcap細(xì)胞經(jīng)過消化、洗滌、離心等操作也有一定比例的細(xì)胞凋亡和壞死，但發(fā)生率較低.在加入藤茶提取物處理24h即發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率顯著上升，且呈量效依賴關(guān)系.提示藤茶提取物可能激活腫瘤細(xì)胞的信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用.

參考文獻

[1]中國科學(xué)院植物所．中國高等植物圖譜補編第2冊[M]．北京:科學(xué)出版社，1983: 242．

[2]陳曉明，倪峰．藤茶藥理作用研究進展[J]．海峽藥學(xué)，2010，22(1): 16－17．

[3]周春權(quán)，姚欣，陳曉明，等．藤茶提取物的抗腫瘤作用研究[J]．中藥新藥與臨床藥理，2011，22(6): 640－642．

[4]倪峰，姚欣，郭丹，等．蛇葡萄素對人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]．中藥藥理與臨床，2012，28(3): 39－41．

[5]倪峰，周金榮．蛇葡萄素及富含蛇葡萄素的總黃酮有效部位在制備防治前列腺癌藥物中的應(yīng)用:中國，ZL200810071687. 2[P]．公告日期．

[6]周春權(quán)，倪峰，林靜瑜，等．藤茶提取物的超聲提取及含量測定[J]．中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，21(3): 2312－2314．

[7]姚欣，倪峰，郭丹，等．蛇葡萄素對人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]．福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014(1): 22－23．

收稿日期:( 2015. 01. 15)

作者簡介:姚欣，男，助理研究員，主要從事中藥學(xué)研究.

基金項目:福建衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)項目(WKJ－FJ－06)，福建省衛(wèi)計委科研項目(WZZE201302).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0026－02

【文獻標(biāo)志碼】A

【中圖分類號】R285. 5