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    大鼠同種異體神經(jīng)支架修復(fù)神經(jīng)缺損的實驗研究

    2016-01-26 03:25:09劉良燚張景石李木衛(wèi)瑒深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院廣東深圳518116
    中國民族民間醫(yī)藥 2015年5期

    劉良燚 劉 凱 張景石 李木衛(wèi) 王 瑒深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院,廣東 深圳 518116

    大鼠同種異體神經(jīng)支架修復(fù)神經(jīng)缺損的實驗研究

    劉良燚劉凱張景石李木衛(wèi)王瑒
    深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院,廣東深圳518116

    【摘要】目的:比較經(jīng)脫細胞處理的同種異體神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與自體神經(jīng)移植修復(fù)效果的區(qū)別.方法: 32只SD大鼠隨機分為2組,每組16只,分別為脫細胞神經(jīng)支架修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損組(A組)和自體移植組(B組).術(shù)后利用HE染色和透射電鏡觀察支架內(nèi)結(jié)締組織重塑情況和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變.結(jié)果:與自體移植組相比,單純脫細胞神經(jīng)支架組細胞分布較紊亂,說明支架內(nèi)結(jié)締組織已有增生重塑現(xiàn)象.通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),單純脫細胞支架組的髓鞘形態(tài)與自體移植組的顯微結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異.結(jié)論:脫細胞異體神經(jīng)支架異體移植后,能與自體神經(jīng)移植修復(fù)缺損神經(jīng)產(chǎn)生相似的移植效果.

    【關(guān)鍵詞】神經(jīng)支架;神經(jīng)缺損;大鼠

    周圍神經(jīng)損傷在臨床上十分常見,尤其長段距離的神經(jīng)缺損修復(fù)一直是困擾臨床的難題,目前自體神經(jīng)移植的修復(fù)方式是臨床首選[1].然而自體移植手術(shù)存在供區(qū)有限、供區(qū)感覺或運動的失神經(jīng)障礙、神經(jīng)束錯位、神經(jīng)活力隨時間衰減以及無血管生成能力等問題[2-3],也是目前臨床應(yīng)用無奈之舉.鑒于此,本研究擬通過比較同種異體脫細胞神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損與運用自體神經(jīng)移植修復(fù)的效果的差異,以期為異體脫細胞神經(jīng)支架作為自體神經(jīng)移植替代治療提供部分研究基礎(chǔ).

    1 材料與儀器

    1. 1儀器3131型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司); H-7650型透射電鏡(日本日立公司);熒光顯微鏡DM4000(德國Leica公司).手術(shù)器械及顯微手術(shù)器械(寧波成和醫(yī)療器械有限公司).

    1. 2材料清潔級雄性SD大鼠,體重(300±42)g,購于中山大學(xué)實驗動物中心;實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(粵)2011-0029,實驗動物使用許可證: SYXK(粵)2011-0112.脫氧膽酸鈉、Triton X-100(美國sigma公司);其余試劑均為分析純.

    2 方法

    2. 1坐骨神經(jīng)取材準(zhǔn)備SD大鼠8只,作為制備脫細胞支架的神經(jīng)供體來源,先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸潤麻醉充分后,再用75%酒精溺斃大鼠,并充分浸泡消毒10分鐘,將消毒后的大鼠置于超凈臺,無菌操作下逐層解剖雙下肢至顯露雙側(cè)坐骨神經(jīng),完整切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)干,8只大鼠共取出坐骨神經(jīng)16條.

    2. 2神經(jīng)支架的制備將大鼠坐骨神經(jīng)干在手術(shù)顯微鏡下小心去除神經(jīng)干周圍筋膜和血管組織,并用無菌PBS緩沖液反復(fù)清洗.在常溫下進行如下步驟[4-5]:①在無菌蒸餾水中靜置6h;②3% TritonX-100中靜置12h;③無菌蒸餾水漂洗3次,然后用無菌PBS緩沖液漂洗3次;④4%脫氧膽酸鈉溶液靜置12h;⑤無菌蒸餾水漂洗3次,然后無菌PBS緩沖液漂洗3次.上述步驟完成以后得到大鼠脫細胞坐骨神經(jīng)支架,將該支架置于PBS緩沖液4℃保存?zhèn)溆?

    2. 3動物分組與坐骨神經(jīng)缺損橋接實驗?zāi)P椭苽淠P椭苽?按照隨機的原則將SD大鼠分為:單純脫細胞支架對照組(A組)和自體移植組(B組),每組16只.常規(guī)消毒術(shù)野,鋪無菌巾,于后肢外側(cè)中上1/3處做橫行切口,切開皮膚約4. 5cm剪開筋膜組織,沿肌間隙由淺入深小心的鈍性分離,充分顯露坐骨神干經(jīng)后,快刀切取長度為1. 5cm的坐骨神經(jīng).形成右坐骨神經(jīng)干缺損動物模型,將脫細胞神經(jīng)支架在10倍手術(shù)顯微鏡下修剪為長度1. 5cm,植于坐骨神經(jīng)干缺損處,用10-0無創(chuàng)縫線,兩定點外膜縫合法吻合坐骨神經(jīng)近端斷端于神經(jīng)支架近端,縫合6針,依法吻合遠端斷端于神經(jīng)支架遠端,創(chuàng)面充分止血,關(guān)閉創(chuàng)面.自體移植組以左右兩側(cè)坐骨神經(jīng)干相互交換的方法進行,術(shù)中注意標(biāo)記切取神經(jīng)干的遠近端,以便正確回植.

    2. 4神經(jīng)再生的組織學(xué)觀察

    2. 4. 1 HE染色取各組支架中段石蠟包埋切片,行常規(guī)HE染色.觀察再生神經(jīng)中的細胞、軸突、髓鞘的形態(tài).

    2. 4. 2超薄切片透射電鏡觀察再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)的變化情況.

    3 結(jié)果

    3. 1一般觀察術(shù)后1. 5個月,兩組營養(yǎng)不良性改變均減輕,兩組再生神經(jīng)外觀均接近正常神經(jīng)組織,B組肌肉萎縮程度較A組輕,A組皮膚感覺及運動功能差于B組.術(shù)后2個月,兩組營養(yǎng)不良性改變均減輕,自體神經(jīng)移植組肌肉萎縮程度輕,對針刺的反應(yīng)敏感度及運動功能恢復(fù)較好.術(shù)后6個月,神經(jīng)取材前觀察神經(jīng)外觀情況,兩組神經(jīng)連續(xù)性良好,與周圍組織無明顯粘連,無纖維神經(jīng)瘤形成,移植段表面均有不同程度的血管化,A組中段較B組略細,B組形態(tài)結(jié)構(gòu)基本接近正常神經(jīng)組織.

    3. 2神經(jīng)支架的光鏡觀察實驗組和對照組的移植物段及其兩端未見肉芽組織,在其橫切面上移植物中段顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束,并有完整的外膜包裹,兩組之間在光鏡觀察無明顯差異.

    3. 3神經(jīng)支架的HE染色分析由蘇木素-伊紅染色結(jié)果可見圖1,在移植物遠段神經(jīng)組織橫切片上,單純脫細胞神經(jīng)支架組、自體神經(jīng)移植組標(biāo)本均可見成束狀排列的神經(jīng)樣組織、藍染的細胞核、新生毛細血管及少量的纖維組織增生,說明神經(jīng)纖維已經(jīng)生長至遠端.此外,自體神經(jīng)移植組組細胞排列較為整齊,細胞核走形較為一致,單純脫細胞神經(jīng)支架組細胞分布較紊亂,細胞核走形較為混亂,說明脫細胞支架內(nèi)結(jié)締組織增生重塑現(xiàn)象明顯.

    3. 4神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)分析由圖2可見,兩組神經(jīng)纖維內(nèi)均可見數(shù)條神經(jīng)軸突纖維,軸突滿布髓鞘,在軸突內(nèi)可見大量微絲、微管、新生毛細血管,細胞器豐富,軸突外有髓鞘包裹,髓鞘呈類圓形或不規(guī)則形,髓鞘壁厚薄均勻,可見同心圈層,髓鞘外周均有雪旺細胞胞質(zhì),胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富,胞核基本規(guī)整.兩組超微結(jié)構(gòu)無十分明顯的差異.

    圖1 神經(jīng)支架HE染色(x100)

    圖2 神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)

    4 討論

    周圍神經(jīng)長距離缺損的修復(fù)一直是臨床難題,自體神經(jīng)移植被認(rèn)為是修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[5].因自體神經(jīng)來源有限以及增加了手術(shù)部位和創(chuàng)傷造成該神經(jīng)支配區(qū)的功能障礙,常無法滿足較大神經(jīng)缺損或較廣泛神經(jīng)損傷修復(fù)的需要.近年來有實驗表明[6-7],脫細胞的同種異體天然神經(jīng)支架優(yōu)于其他人工制備的支架,不僅在于有較好的組織相容性,主要還在于去除有抗原性的細胞和髓鞘,而保留了抗原性極小的基底膜作為支架引導(dǎo)軸突沿移植物內(nèi)管向遠端生長,引導(dǎo)宿主許旺細胞沿其內(nèi)管壁向移植段遷移和增殖,避免或極大地減輕宿主的免疫排斥反,使軸突再生通過一段較長距離成為可能.同時獲得以施萬細胞基底膜管(SCBL)為主的神經(jīng)外基質(zhì)構(gòu)成的三維管狀支架材料.軸突再生的研究表明,SCBL是由含豐富層黏蛋白(LN)的細胞外基質(zhì)組成,它能夠促進宿主施萬細胞向神經(jīng)移植段內(nèi)遷移,引導(dǎo)軸突沿著SCBL的內(nèi)面生長[8].

    本實驗大體組織觀察發(fā)現(xiàn):脫細胞神經(jīng)移植段周圍組織黏連及瘢痕形成較輕微,神經(jīng)連續(xù)性良好,無移植段吸收現(xiàn)象.說明脫細胞同種異體神經(jīng)與自體神經(jīng)一樣,是良好的神經(jīng)缺損橋接修復(fù)材料,光鏡觀察發(fā)現(xiàn)脫細胞神經(jīng)移植段中央顯示大量的再生神經(jīng)纖維集合形成許多由束膜包繞的神經(jīng)束,并有完整的外膜包裹,出現(xiàn)大量髓鞘形成的早期像,軸索位于橢圓形施萬細胞的一側(cè).

    經(jīng)3% Triton X-100和4%脫氧膽酸鈉萃取的脫細胞同種異體神經(jīng)支架,其神經(jīng)修復(fù)過程未表現(xiàn)出對大鼠機體及周圍組織的毒性及炎癥刺激,新生神經(jīng)軸突微管、微絲、毛細血管、細胞器等結(jié)構(gòu),髓鞘可見同心圓狀板層結(jié)構(gòu),雪旺細胞核清晰可見,其與自體神經(jīng)移植修復(fù)無明顯差異.說明此種脫細胞同種異體神經(jīng)支架有作為神經(jīng)缺損修復(fù)的橋接物的潛力,可作進一步研究.

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    收稿日期:( 2014. 12. 11)

    作者簡介:劉良燚(1980-),男,漢族,貴州遵義人,碩士,主治醫(yī)生,研究方向為周圍神經(jīng)修復(fù).E-mail: liuliangyi3@163. com

    基金項目:深圳市龍崗區(qū)科技局項目(ys2012187).

    【文章編號】1007-8517(2015)05-0073-02

    【文獻標(biāo)志碼】A

    【中圖分類號】R745

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