纖維素酶
——半纖維素酶提取泡姜姜辣素*

楊　毅，葉樹帆，任小麗，崔秋兵

(內(nèi)江師范學院化學化工學院，四川　內(nèi)江　641100)

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纖維素酶
——半纖維素酶提取泡姜姜辣素*

楊毅，葉樹帆，任小麗，崔秋兵

(內(nèi)江師范學院化學化工學院，四川內(nèi)江641100)

對纖維素酶和半纖維素酶聯(lián)合提取泡姜姜辣素的工藝進行研究。以泡姜粉為原料，50%乙醇作溶劑。選擇香草醛作為標準對照品，通過紫外分光光度法，在280 nm處測定提取液中姜辣素的含量。通過單因素實驗和正交優(yōu)化設(shè)計實驗，得到最佳提取條件：固液比2:200(g:mL)，混合酶加量3 mg，酶解溫度45 ℃，酶解時間2 h，泡姜姜辣素的提取率為1.69%。

纖維素酶；半纖維素酶；泡姜；姜辣素

生姜含有辛辣成分和芳香成分，其芳香成分是姜精油，具有揮發(fā)性；其辛辣成分是姜辣素(姜酚)及分解物6-姜烯酚、8-姜烯酚，姜辣素的組分是由多種物質(zhì)構(gòu)成的混合物[1]，不具有揮發(fā)性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，姜辣素是生姜諸多藥用學價值的主要功能組分[2-3]。

姜辣素具有抑制血小板聚集、保護心血管、降血糖、改善胃腸道功能、增強免疫力、降血脂、抗炎、保肝利膽、抗微生物、抗衰老、防輻射、抗腫瘤等作用，還有很強的抗氧化能力。因此，姜辣素在食品、藥品、化妝品、保健品等方面，具有很好的應(yīng)用價值[4-7]。

泡姜屬于四川傳統(tǒng)的風味泡菜，其口感與生姜有很大不同，經(jīng)過泡制，姜辣素的成分、含量及藥用價值，是否發(fā)生變化，這些問題，見于報道的量很少，因此，其值得深入研究。目前，姜辣素的主要提取方法有，溶劑抽提法、壓榨法、超臨界CO2萃取、超聲波或微波輔助提取等[8-10]。但上述方法，設(shè)備要求較高，工藝比較復(fù)雜，耗費時間長。纖維素在生姜細胞壁中的含量很高，使得姜辣素的溶出受到很大限制。姜辣素和其他成分主要通過濃度梯度逐漸擴散到溶劑中，這樣既造成提取酶解時間長，耗用的溶劑多，又使得提取不完全。半纖維素是植物細胞壁中與纖維素共生的植物多糖，其含量僅次于纖維素，使用半纖維素酶將半纖維素轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)[11]，可以讓姜辣素快速溶出。本實驗采用生物酶技術(shù)提取泡姜中的姜辣素，以期探索出一種工藝簡單、設(shè)備要求低、提取效率高的提取方法，為泡姜姜辣素的成分、含量、活性和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　實　驗

1.1原料、試劑與儀器

泡姜：購自內(nèi)江市農(nóng)貿(mào)市場。

無水乙醇，成都金山化學試劑有限公司；香草醛，天津市巴斯夫化工有限公司；纖維素酶(50 U·mg-1)、半纖維素酶(20000 U·mg-1)，上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉，成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純。

SHA-B 雙功能恒溫水浴震蕩器，上海璽袁科學儀器有限公司；TGL-10C高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-752紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海興創(chuàng)科學儀器設(shè)備有限公司；DFY-600 600克搖擺式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1泡姜粉的制備

將泡姜洗凈切片，自然風干，然后于50 ℃下烘干至易折斷為止。用粉碎機粉碎，過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2姜辣素測定

目前，姜辣素的測定有溶出伏安法、高效液相色譜法、滴定法、熒光法、光度法、薄層掃描法、氣相色譜或與質(zhì)譜聯(lián)用以及 LC/ESI- MS/MS法等。張明昶等[12]選用香草醛為標準對照品，將其無水乙醇溶液用紫外分光光度計進行掃描，在最大吸收波長，280 nm 處測定樣品中的姜辣素含量，此法快速、高效、可行。

1.2.3香草醛標準曲線的繪制[13]

準確稱取0.2 g香草醛，用50%乙醇溶解并定容成100 mL，準確移取5.0 mL到50 mL容量瓶中定容，配成200 μg/mL的標準溶液。并用50%乙醇配成2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的香草醛標準溶液。以溶劑作為空白，于280 nm處測定吸光度值。得回歸方程：

A=0.06393c+0.031，R2=0.9993

1.3姜辣素的提取[14]

以1:1的比例將纖維素酶和半纖維素酶配制成混合酶溶液，用檸檬酸和檸檬酸三鈉配制pH為 5.00的緩沖溶液，兩者均以50%乙醇作為溶劑。準確稱取0.15 g泡姜粉于25 mL具塞比色管中，加入2 mL酶液、8 mL緩沖溶液，在45 ℃下，水浴加熱2 h。然后離心10 min，移取1 mL上清液用50%乙醇定容至10 mL，根據(jù)上述方法，檢測溶液吸光度，計算提取率。姜辣素提取率的計算方法[15]如下：

式中：X——姜辣素產(chǎn)率，%

2.003——香草醛與姜辣素的換算系數(shù)

ρ——姜辣素質(zhì)量濃度，μg/mL

V——待測液的總體積，mL

Q——稀釋倍數(shù)

1.4泡姜姜辣素提取的單因素試驗

準確稱取0.1 g泡姜粉于具塞比色管中，以固液比為2:200、酶解溫度為45 ℃、混合酶加量為10 mL(2 mL混合酶液和8 mL緩沖溶液)、酶解時間為2 h作為基礎(chǔ)條件。在固定其他各因素水平條件下，分別考查固液比1:200、2:200、3:200、4:200、5:200(g:mL)，酶解溫度30、35、40、45、50 ℃，混合酶加量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，酶解時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、2.5 h時對姜辣素產(chǎn)率的影響。

1.5正交設(shè)計優(yōu)化泡姜姜辣素的提取

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選定固液比、混合酶加量、酶解溫度、酶解時間4個因素，設(shè)計L9(34)正交試驗，據(jù)此選出最佳的提取條件。正交試驗因素與水平表見表1。

表1　影響泡姜姜辣素提取率的因素水平表Table 1　Effect of pickled ginger oleoresin ginger extraction rate factor levels

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗對于泡姜姜辣素提取率的影響

2.1.1固液比

在3Dmax中按照真實采集人體骨骼的比例，對模型進行調(diào)整，統(tǒng)一軸心與質(zhì)心位置，制作出三維結(jié)構(gòu)與真實模型一致的精細模型，如圖2所示。

其他條件固定不變，在不同的固液比下，提取泡姜姜辣素的實驗結(jié)果如圖1。

由圖1可得，隨著固液比的減小，姜辣素產(chǎn)率逐漸增大，當固液比為2:200(g:mL)時，姜辣素產(chǎn)率出現(xiàn)最大值為1.42%，若繼續(xù)減小固液比，產(chǎn)率反而有所減小。這可能是因為適當減小固液比時有利于姜辣素溶解到溶劑中，當固液比過小會造成其它雜質(zhì)溶解到溶劑中去，造成姜辣素擴散速率降低，對溶解起到抑制作用。

圖1　固液比對泡姜姜辣素提取率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.2混合酶加量

其他條件固定不變，在不同的混合酶加量下，提取泡姜姜辣素的實驗結(jié)果如圖2。

由于生物酶的作用非常高效，據(jù)圖2可得，混合酶加量增大，提取率持續(xù)升高，在2 mg時，提取率達到1.42%，說明當酶加量為2 mg時足以對0.1 g泡姜細胞壁完全分解。再增加酶的用量會增加酶對提取物的副作用，使得產(chǎn)率會降低。

圖2　酶加量對泡姜姜辣素提取率的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.3酶解溫度

其他條件固定不變，在不同的溫度下，提取泡姜姜辣素的實驗結(jié)果如圖3。

由圖3可得，隨酶解溫度的增加，姜辣素產(chǎn)率迅速提高，當溫度達到45 ℃時出現(xiàn)峰值1.54%，溫度再增加，產(chǎn)率反而降低。這可能是因為酶可加快提取速率但酶對溫度很敏感，在適當溫度范圍內(nèi)，酶的活性隨溫度的增加而增強，當溫度過高時，高溫破壞了酶的活性，使得活性降低，產(chǎn)率減少。因此會在45 ℃時出現(xiàn)最大值。

圖3　酶解溫度對泡姜姜辣素提取率的影響Fig.3　Effects of temperature on the extraction rate of gingerol pickled ginger

2.1.4酶解時間

其他條件固定不變，在不同的酶解時間下，提取泡姜姜辣素的實驗結(jié)果如圖4。

由圖4可得，隨著酶解時間變長，姜辣素的提取率不斷增加，在2.0 h達到最大，為1.43%，繼續(xù)增加酶解時間，提取率有所降低。這可能是因為酶對姜辣素的提取有兩個方面的作用：①破壞細胞壁使得姜辣素更容易溶解出來；②酶對姜辣素也有一定的降解作用。因此產(chǎn)率是由這兩個因素共同決定的，在前期的時，第一個因素起主導(dǎo)作用，導(dǎo)致產(chǎn)率不斷增加。在后期時，細胞壁基本上已被破壞，第二個因素將起主導(dǎo)作用，使得產(chǎn)率有所降低。因此圖像會出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖4　酶解時間對泡姜姜辣素提取率變化的影響Fig.4　Enzymolysis time of pickled ginger ginger oleoresin extraction rate change

2.2正交試驗優(yōu)化與分析

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，把姜辣素提取率作為目標參數(shù)，以固液比、混合酶加量、酶解溫度、酶解時間4個因素進行正交試驗，其結(jié)果見表2。

表2　正交試驗結(jié)果表Table 2　Table of orthogonal test results

續(xù)表2

623121.61731321.54832131.43933211.46K11.4501.5101.4601.453K21.6071.5001.5401.553K31.4471.5231.5331.527R0.1570.0230.0800.100

由表2可得，把姜辣素提取率作為目標參數(shù)，4個因素對于泡姜姜辣素提取率的影響，按由大到小為：固液比>酶解時間>酶解溫度>混合酶加量。直觀分析表明，提取的最佳條件為A2B3C2D2，即固液比2:200(g:mL)，酶加量3 mg，酶解溫度45 ℃，酶解時間2 h。因為最佳組合不在正交設(shè)計內(nèi)，所以需要做驗證試驗。

2.3最佳工藝條件驗證

根據(jù)正交設(shè)計試驗選出的最佳組合A2B3C2D2做3次平行試驗，得到姜辣素的平均提取率為1.69%，表明正交試驗確定的組合條件為最優(yōu)。

3　結(jié)　論

以生物酶酶解過程為主要工藝，50%乙醇作溶劑提取泡姜姜辣素，探索纖維素酶和半纖維素酶協(xié)同作用在提取泡姜姜辣素方面的應(yīng)用。通過研究固液比、混合酶加量、酶解溫度、酶解時間四個因素對提取率的影響，得知姜辣素的提取率受酶的影響較大，少量的酶即可明顯提高產(chǎn)率。選用正交實驗法。得到最佳的泡姜姜辣素提取條件為固液比2:200(g:mL)，酶加量3 mg，酶解溫度45 ℃，酶解時間2 h，泡姜姜辣素的提取率為1.69%。此法工藝過程簡單，設(shè)備要求低，快速可行，對泡姜活性成分的進一步研究有一定價值。

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Cellulase Hemicellulase-extract of Pickled Ginger Oleoresin*

YANGYi，YEShu-fan，RENXiao-li,CUIQiu-bing

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Neijiang Normal University, Neijiang,Sichuan 641100, China)

Cellulase and hemicellulase combined extraction of pickled ginger gingerol technology was researched with pickled ginger powder as raw materials, 50% ethanol as the solvent. Vanillin was selected as a standard control, on the basis of UV spectrophotometry, extraction of gingerol was determined in 280 nm. Through single factor experiments and orthogonal optimization experiment design, the optimum extraction conditions were obtained as follows: solid-liquid ratio of 2:200 (g:mL), mixed enzyme dosage of 3 mg, enzymatic hydrolysis temperature of 45 ℃, enzymolysis time 2 h, pickled ginger oleoresin extraction rate was 1.69%.

gellulase; hemicellulase; pickled ginger; oleoresin ginger

內(nèi)江師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)科技項目(X201508)。

楊毅，男，研究方向：天然產(chǎn)物提取及合成研究。

崔秋兵，女，研究方向：中藥及天然產(chǎn)物活性成分。

TS202.3

A

1001-9677(2016)018-0085-04