高分辨率熔解曲線分析法檢測大腸埃希菌gyrA基因突變

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高分辨率熔解曲線分析法檢測大腸埃希菌gyrA基因突變

隨著喹諾酮類藥物在臨床和畜牧業(yè)的廣泛應用，大腸埃希菌對喹諾酮類藥物已呈現(xiàn)相當高的耐藥率[1-2]。gyrA基因突變造成的DNA旋轉酶A亞單位(GyrA)結構改變是大腸埃希菌對喹諾酮類藥物耐藥的最重要機制[3-4]。目前對gyrA突變的研究方法有：擴增喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region，QRDR)后基因測序分析、限制性內切酶Hinf Ⅰ的酶切進行限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、單鏈構象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism， SSCP)分析等方法[5-8]。這些方法需有專門的設備,檢測費用昂貴，操作煩瑣,需要一定的技術和經(jīng)驗，并且都存在一定的檢測局限性。高分辨率熔解曲線(high-resolution melting， HRM) 分析技術是近年來發(fā)展起來的分子生物學新技術。用新型飽和染料(LC Green、LC Green PLUS、SYTO 9和Eva Green等)代替?zhèn)鹘y(tǒng)熔解曲線分析中的非飽和染料SYBER GreenN對PCR的擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析，根椐溶解溫度(melting temperature,Tm)值和熔解曲線的峰形來分析擴增的目的基因,有非常高的靈敏度，且不需要專門的檢測設備，在一些加裝了分析模塊的常規(guī)定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction， PCR)儀上也可以檢測分析。目前HRM技術已被應用于基因分型、序列匹配、突變掃描等領域，有著廣泛的應用前景。為了探索HRM技術檢測大腸埃希氏菌的gyrA基因突變的可行性，我們采用序列分析法和HRM技術分別檢測了70株臨床分離的大腸埃希菌gyrA基因的突變情況。

材料和方法

一、菌株來源

70株大腸埃希菌均分離自2010年2月至2011年8月連云港市第一人民醫(yī)院臨床標本, 包括尿液、痰、血標本和其它標本,排除重復菌株。所有菌株均經(jīng)西門子MicroScan WalkAway-96 Plus 全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定，其中環(huán)丙沙星敏感38株、耐藥32 株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853，均購自國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心。

二、 方法

1.大腸埃希菌gyrA基因QRDR的突變檢測參照文獻[8]設計引物，PCR擴增所有70株大腸埃希菌株gyrA基因的QRDR片段，引物序列為F: 5′-CTCCTATCTGGATTATGCG-3′、R：5′-GGTCGATAGAACCGAAGTTA-3′，由上海生工生物有限公司合成，擴增產(chǎn)物長度為284 bp,位于QRDR的第19～113位密碼子。PCR反應混合體系Perfect ShotTMTaq購自寶生物工程大連有限公司。GeneAmp 2700 PCR擴增儀為美國PE公司產(chǎn)品。菌株DNA提取參考文獻[9]稍作改動：挑取一營養(yǎng)瓊脂37 ℃過夜培養(yǎng)的中等大小菌落于50 μL無菌蒸餾水中，95 ℃ 10 min裂解細菌，釋放DNA，10 000×g離心10 min，取上清液作為DNA模板。PCR擴增條件參照文獻[8],循環(huán)數(shù)為30次。將擴增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測序，測得序列用blast 軟件與敏感株K011(Genbank登記號：CP002516.1)做序列比對，檢測是否有突變、突變位點及堿基變化。

結果

一、gyrA基因測序結果

對70株大腸埃希菌gyrA基因進行普通PCR擴增并測序。結果顯示共有43株(61.4%)gyrA基因發(fā)生突變,有27株(30.6%)為未突變的野生株，突變發(fā)生在83位密碼子TCG→TTG、85位密碼子GTT→GTC、87位密碼子GAC→AAC及91位密碼子CGT→CGC 4個位點，其中單一位點突變11株，多位點突變32株。依椐gyrA基因突變的不同位點數(shù)和類型將70株菌株分成野生(未發(fā)生突變)和Ⅰ(24株，2點突變)、Ⅱ(15株，1點突變)、Ⅲ(14株，3點突變)、Ⅳ(2株，4點突變)、Ⅴ(2株，2點突變)5個組,見圖1、圖2及表1。

圖1　部分菌株gyrA基因普通PCR擴增電泳圖

二、gyrA基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析結果

gyrA基因突變株HRM與未發(fā)生突變的野生株有明顯差異，可以準確區(qū)分野生株和突變株，準確率達98.6%(69/70); 43株gyrA基因突變株檢出42株,敏感性為97.7%(42/43),其中只發(fā)生1個堿基突變的11株突變株(Ⅱ組)均被正確檢出。檢出的42株突變株按不同突變類型被正確分組。見圖3、圖4。

三、gyrA基因擴增產(chǎn)物的Tm檢測結果

注：箭頭示處為突變位點

圖2　發(fā)生多點突變位的gyrA基因測序圖

圖3　70株大腸埃希菌溶解曲線標準化圖形

圖4　70株大腸埃希菌溶解曲線標準化溫度差異圖形

圖5　70株大腸埃希菌的Tm峰形圖

討論

促旋酶A亞單位編碼基因gyrA突變而導致促旋酶結構改變是大腸埃希菌耐喹諾酮類藥物的最重要機制，改變主要位于編碼67～106氨基酸的密碼子之間,這個區(qū)間通常稱為QRDR。對應的gyrA基因最常見的突變?yōu)?3位密碼子TCG→TTG、87位密碼子GAC→AAC、91位密碼子CGT→CGC等[5,11]。研究表明突變的類型不同和突變點的多寡對于喹諾酮類藥物的MIC值有明顯影響[4]。

目前,研究gyrA突變的方法中以測序法最為可靠也最準確，能夠確定突變的類型和位置，但是需有基因測序設備，且檢測費用昂貴。RFLP法主要利用gyrA基因突變中最常見為的83位密碼子堿基C→T突變的特點，但是突變如不是發(fā)生在83位密碼子上就可能發(fā)生漏檢。SSCP是依據(jù)點突變引起單鏈DNA分子立體構象的改變來實現(xiàn)電泳分離的。這種方法的不足是某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小，再加上其它條件的影響，使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。這幾種方法都需要一定的技術和經(jīng)驗，而且都是2個步驟的分析，操作較為煩瑣且較易發(fā)生樣本污染，所以都存在一定的局限性。

HRM分析法是用新型飽和染料代替?zhèn)鹘y(tǒng)熔解曲線分析中的非飽和染料對PCR的擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析[12]。該檢測技術近年來已應用于臨床微生物檢驗中的菌種鑒定、耐藥機制檢測等多個研究領域[13-16]。它主要根椐突變株發(fā)生堿基突變后DNA的GC含量與野生株不同而導致的Tm值和熔解曲線峰形的差異，通過基因掃描敏感地鑒別突變株和野生株的DNA。從已有的研究報道和前期的測序結果表明：大腸埃希菌gyrA基因最常見的突變位點均由堿基G或C突變?yōu)門或A。由于DNA的GC含量發(fā)生了改變，必然會導致DNA的Tm值和熔解曲線峰形發(fā)生改變，這就使HRM技術快速檢測出大腸埃希菌gyrA基因突變成為可能。2007年，SLINGER 等[10]報道了將HRM技術應用于沙門氏菌gyrA基因的突變檢測，成功檢測出了臨床分離的沙門氏菌gyrA突變株。但SLINGER等[10]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌gyrA基因只是單位點的突變。然而本研究對臨床分離的70株大腸埃希菌gyrA基因測序表明：大腸埃希菌的gyrA基因突變有單位點、雙位點、多位點突變的情況存在，突變型遠較沙門氏菌復雜。本研究運用HRM技術對臨床分離的70株大腸埃希菌gyrA基因突變進行檢測，與基因測序法相比正確率達到98.6%(69/70),對檢測出的42株突變株的突變型能正確地鑒別分組。整個實驗過程從挑取細菌單菌落制備模板DNA、試劑準備、熒光定量PCR擴增到熔解曲線分析可在1～2 h內完成，1次最多可完成96個樣本檢測，符合微生物快速診斷的發(fā)展以及大樣本檢測的要求。如果在檢測過程中加入已知突變位點和突變型的菌株作參考菌株，將待檢菌株的分析曲線或Tm值與參考菌株作比較可以直接檢測出待檢菌的突變點和突變類型，無需做后續(xù)的基因測序，成本低廉。且由于檢測為封閉不開蓋連續(xù)檢測，避免了樣本污染，擴增產(chǎn)物還可以用來做其它實驗分析。本研究顯示HRM技術檢測大腸埃希菌gyrA基因突變具有簡單、快速、準確優(yōu)點，可以作為檢測大腸埃希菌耐藥機制的新選擇。由于本研究檢測的樣本數(shù)不夠多，因此利用HRM技術檢測大腸埃希菌gyrA基因突變的可行性還需要加大樣本量進一步驗證。

由于HRM技術是基于突變菌株DNA中GC含量發(fā)生改變的原理，所以當細菌基因發(fā)生多位點突變，且多個突變的GC改變相互抵消導致發(fā)生突變后的DNA的GC含量與野生株相同的情況下，HRM技術就無法正確檢測到這種突變。本研究第Ⅳ組菌株由于發(fā)生了4個位點突變， 突變的堿基改變相互抵消后DNA與野生株相比堿基改變?yōu)镚→A 、T→C，無明顯GC含量改變，Tm值(83.96)變化不大，造成有一株菌的突變沒有被檢測出來，這是HRM技術檢測細菌基因多位點突變的方法學的局限性。

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茆海豐，劉洪書

(連云港市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222002)

摘要：目的探討高分辨率溶解曲線(HRM)分析法在檢測大腸埃希菌gyrA基因突變中的可行性。方法收集臨床非重復分離的大腸埃希菌70株，常規(guī)聚合酶鏈反應(PCR)擴增大腸埃希菌的gyrA基因，采用序列分析法檢測gyrA基因的變異情況。設計特異性引物，采用熒光定量PCR擴增這70株大腸埃希菌株的gyrA基因，通過對擴增產(chǎn)物進行HRM分析和熔解溫度(Tm)值測定確定gyrA基因變異情況。將檢測結果與序列分析法檢測結果進行比較。結果基因測序顯示70株大腸埃希菌中有43株gyrA基因發(fā)生了突變，突變類型分為5型。HRM分析法可以準確區(qū)分野生株和突變株，準確率達98.6%(69/70),正確檢測出了43株突變菌株中的42株，且對不同的突變類型準確分型。Tm分析顯示野生株和突變株之間以及各種突變型之間有明顯差異。結論HRM技術具有準確性高、簡單、快速、成本低廉、高通量等優(yōu)點，可以作為檢測大腸埃希氏菌gyrA基因突變耐藥機制的新選擇。

關鍵詞：大腸埃希菌; gyrA基因; 高分辨率熔解曲線

The detection ofgyrAgene mutation inEscherichiacoliby high-resolution melting analysisMAOHaifeng，LIUHongshu.(TheFirstPeople′sHospitalofLianyungangCity,JiangsuLianyungang222002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of high-resolution melting (HRM) analysis to detect gyrA gene mutation in Escherichia coli. MethodsA total of 70 isolates of Escherichia coli were collected, and gyrA gene was amplified with conventional polymerase chain reaction(PCR). Gene mutation was detected by sequence analysis. Specific primer was designed. The gyrA gene was amplified by fluorescence quantitation PCR. The mutation of gyrA gene was detected by amplifying product HRM curve and melting temperature (Tm) analysis. The result was compared with that of gene sequence analysis. ResultsgyrA gene mutation sequence analysis showed that 43 of 70 isolates occurred gyrA gene mutation. In these mutations, 5 types were found. HRM analysis can accurately distinguish between wild and mutant isolates. The detection accuracy was 98.6% (69/70).The 42 of 43 mutant isolates were correctly detected, and different type gene mutations can be correctly typed. Tm analysis also showed the difference of wild and mutant isolates. ConclusionsHRM analysis is accurate, simple, rapid, cheap and high-throughput, and it and would be a novel choice in analyzing drug resistance mechanism of Escherichia coli.

Key words:Escherichia coli; gyrA gene; High-resolution melting

收稿日期：(2015-01-12)

作者簡介：茆海豐，男，1969年生，碩士，主任技師，主要研究方向為細菌耐藥機制。

基金項目：江蘇省連云港市衛(wèi)生局科研項目(11014)

中圖分類號：(本文編輯：范基農)

文章編號：1673-8640(2015)11-1138-05Q503 1673-8640(2015)11-1143-04R446.1

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.018 ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.019