流式細(xì)胞術(shù)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析

朱宇清，　朱　俊，　徐　翀

(上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126)

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流式細(xì)胞術(shù)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析

朱宇清，朱俊，徐翀

(上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126)

摘要：目的通過分析衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心、上海市臨床檢驗(yàn)中心的淋巴細(xì)胞亞群室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(EQA)報(bào)告數(shù)據(jù)以及上海市2家實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控上報(bào)數(shù)據(jù)，探討目前國(guó)內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)EQA評(píng)判規(guī)則的合理性，為進(jìn)一步提高國(guó)內(nèi)該檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)量水平提供依據(jù)。方法對(duì)BD流式細(xì)胞儀用戶組2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心及2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次淋巴細(xì)胞亞群EQA報(bào)告數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各濃度質(zhì)評(píng)樣本上報(bào)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(CV)，選取上海市2家BD流式細(xì)胞儀用戶2014年9月至2015年4月期間的淋巴細(xì)胞亞群室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，計(jì)算月s和月CV值。并對(duì)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心第201403和201405號(hào)質(zhì)評(píng)樣本CD3+CD4+百分比(CD3+CD4+%)項(xiàng)目(靶值分別為42.7%、42.1%)、上海市臨床檢驗(yàn)中心第1521和1525號(hào)質(zhì)評(píng)樣本 CD3+CD4+%項(xiàng)目(靶值分別為43.2%，44.13%)的回報(bào)數(shù)據(jù)以及2家上海市臨床實(shí)驗(yàn)室CD3+CD4+%項(xiàng)目中值水平(月組均值為44.39%～46.80%)室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。結(jié)果2014衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心5份EQA樣本的s為1.10%～1.55%，CV為3.1%～5.5%，平均CV為3.36%；2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次EQA 5份樣本的s為0.67%～1.63%，CV為3.51%～8.64%，平均CV為4.83%。在樣本CD3+CD4+%值相近的情況下，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2個(gè)EQA樣本組s(1.55%、1.35%)和組CV(3.6%、3.2%)、上海市臨床檢驗(yàn)中心2個(gè)EQA樣本的組s(1.63%、1.55%)和組CV(3.78%、3.51%)均在上海市2家臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控月s(1.06%～2.44%、0.98%～2.03%)和月CV(2.18%～5.28%、2.14%～4.35%)的變化范圍之內(nèi)。結(jié)論由于儀器品牌和型號(hào)、溶血方法、熒光抗體的品牌和用量、設(shè)門方法、實(shí)驗(yàn)人員、環(huán)境條件等不同因素的影響，EQA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中的s和CV低于室內(nèi)質(zhì)控的s和CV不合理。其原因可能是部分參與EQA的實(shí)驗(yàn)室在數(shù)據(jù)上報(bào)前對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了交流、核對(duì)和更改。當(dāng)前除了加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量教育外，EQA組織者還需要探討建立更合適的質(zhì)控規(guī)則。

淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)影響機(jī)體免疫系統(tǒng)的多種因素的診斷和監(jiān)測(cè)提供了重要信息。上世紀(jì)80年代，研究者發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)因破壞CD4+T細(xì)胞而導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，此發(fā)現(xiàn)也成為流式細(xì)胞術(shù)從研究工具轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｒ?guī)診斷技術(shù)的原動(dòng)力[1]，同時(shí)也激勵(lì)科學(xué)家和臨床病理學(xué)家迅速建立了多種準(zhǔn)確、可靠的CD4+T細(xì)胞百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)的方法[2]，也激發(fā)了臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment, EQA)需求的增加，促使一系列國(guó)際間協(xié)作研究組織的誕生。目前，我國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和上海市臨床檢驗(yàn)中心也已建立了淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的EQA計(jì)劃，為提高國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)準(zhǔn)確度起到了積極作用。我們對(duì)2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群EQA數(shù)據(jù)以及2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群EQA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并結(jié)合上海市2家實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，探討國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室可能存在的問題或趨勢(shì)。

材料和方法

由于國(guó)內(nèi)開展CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量很少，上海市開展絕對(duì)計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)室僅為5家，故僅對(duì)CD4+T細(xì)胞百分比(CD3+CD4+%)結(jié)果進(jìn)行探討。本研究所采用的數(shù)據(jù)包括2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心淋巴細(xì)胞亞群BD儀器組EQA數(shù)據(jù)、2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群BD儀器組EQA數(shù)據(jù)以及上海市2家BD儀器組臨床實(shí)驗(yàn)室自2014年9月至2015年4月的室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)。

結(jié)果

一、 2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心淋巴細(xì)胞亞群EQA數(shù)據(jù)

二、 2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群EQA數(shù)據(jù)

2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次EQA樣本編號(hào)為1521～1525，共5份。按回報(bào)數(shù)據(jù)計(jì)算出BD儀器組的s和CV，見表2。5份EQA樣本的s為0.67%～1.63%，CV為3.51%～8.64%，平均CV為4.83%。

表1　2014年衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心淋巴細(xì)胞

三、上海市2家臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控上報(bào)數(shù)據(jù)

表2　2015年上海市臨床檢驗(yàn)中心第1次

表3　實(shí)驗(yàn)室A和B流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群室內(nèi)質(zhì)控上報(bào)數(shù)據(jù)　(%)

四、數(shù)據(jù)比較

在樣本CD3+CD4+%值相近的情況下，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心2個(gè)EQA樣本和上海市臨床檢驗(yàn)中心2個(gè)EQA樣本的組s值和組CV值均在上海市2家臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控月s和月CV的變化范圍之內(nèi)。說明衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和上海市臨床檢驗(yàn)中心EQA的s值和CV值低于一些臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控的月s值和CV值。

討論

實(shí)驗(yàn)室參加EQA活動(dòng)可以從中獲得如下益處：通過EQA可以確認(rèn)并監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，能幫助實(shí)驗(yàn)室確定所采用的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度并識(shí)別檢測(cè)方法中存在的問題，教育員工并建立信心，監(jiān)測(cè)員工的能力等。但這些都應(yīng)基于EQA能夠科學(xué)、準(zhǔn)確地反映所有參加者能力水平的真實(shí)情況。

本研究發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)-淋巴細(xì)胞亞群EQA有部分?jǐn)?shù)據(jù)的s和CV低于實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控的s和CV。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)項(xiàng)目所具有的特殊性決定了其受到的影響因素多于其他常規(guī)的生化和免疫的定量檢測(cè)項(xiàng)目。其影響因素及其對(duì)室內(nèi)質(zhì)控和EQA的不同作用見表4。

綜合上述信息來看，上海市的2家臨床實(shí)驗(yàn)室按規(guī)定進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控樣本檢測(cè)并定期如實(shí)上報(bào)室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，操作人員具有較強(qiáng)的質(zhì)量控制意識(shí)；相對(duì)而言，國(guó)內(nèi)還有相當(dāng)一部分實(shí)驗(yàn)室并未能做到每次進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)工作的同時(shí)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控樣本的檢測(cè)，質(zhì)控意識(shí)較為薄弱。因此，EQA的s和CV低于實(shí)驗(yàn)室A和B的室內(nèi)質(zhì)控s和CV的原因可能是EQA數(shù)據(jù)并未能夠反映參與EQA的實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況。

另外，根據(jù)國(guó)外相關(guān)機(jī)構(gòu)組織的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)EQA計(jì)劃的經(jīng)驗(yàn)來看，參與實(shí)驗(yàn)室之間的s和CV的減小也需經(jīng)歷相應(yīng)的過程。

在穩(wěn)定化處理的質(zhì)控血研制成功之前，EQA樣本為新鮮全血。根據(jù)上世紀(jì)90年代初已發(fā)表的多中心協(xié)作研究報(bào)道，對(duì)于HIV陰性新鮮全血樣本的CD4+T細(xì)胞百分比(CD4+%)項(xiàng)目，可接受的CV值是<15%[3-4]。

表4　各種影響因素對(duì)室內(nèi)質(zhì)控和EQA的作用差異

自1990年起，國(guó)際上就已逐步建立了數(shù)種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群的方法。由于臨床決斷對(duì)于淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果的依賴性日益提高，針對(duì)淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的國(guó)家和國(guó)際指南以及EQA計(jì)劃陸續(xù)建立[8]。GLENCROSS等[9]報(bào)道在4年里同時(shí)采用非洲地區(qū)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃(African Regional External Quality Assessment Scheme, AFREQAS)和QASI質(zhì)評(píng)樣本共進(jìn)行了20輪試驗(yàn)。當(dāng)各參與實(shí)驗(yàn)室使用各自常規(guī)使用的方法時(shí)，對(duì)于中值CD4+T細(xì)胞的質(zhì)評(píng)樣本，AFREQAS實(shí)驗(yàn)室間平均CV為7.3%、QASI的CV為8.8%。對(duì)于低值CD4+T細(xì)胞質(zhì)評(píng)樣本，AFREQAS的CV為10.7%、QASI的CV為15.1%。而如果參與實(shí)驗(yàn)室采用相同檢測(cè)方法，如全白細(xì)胞設(shè)門(panLeuco gating，PLG)檢測(cè)方法時(shí)，則CD4+T細(xì)胞中值樣本的CV為4.2%，低值樣本CV為5.5%。

HULTIN等[10]報(bào)道，在美國(guó)國(guó)家過敏和感染性疾病研究院AIDS部免疫學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)(the National Institute of Allergy and Infectious Disease，Division of AIDS Immunology Quality Assessment, NIAID-IQA)能力驗(yàn)證項(xiàng)目的主導(dǎo)下，采用未加穩(wěn)定劑的新鮮血液，連夜送往4家AIDS多中心隊(duì)列研究(multicenter AIDS cohort study, MACS)實(shí)驗(yàn)室，確保在抽血之后30～36 h檢測(cè)。所有4家MACS實(shí)驗(yàn)室自成立以來都已參加NIAID-IQA能力驗(yàn)證項(xiàng)目，都采用免洗溶血素和CD45設(shè)門法。研究結(jié)果表明，即使使用未加穩(wěn)定劑的新鮮血液樣本，低值CD4+T細(xì)胞樣本的CV[中位數(shù)(四分位間距)]為3.7%(3.4%～6.6%)，中值CD4+T細(xì)胞樣本的CV[中位數(shù)(四分位間距)]為2.4%(1.5%～2.9%)，總體CV[中位數(shù)(四分位間距)]為2.8%(1.9%～3.7%)。總體CV明顯低于SCHNIZLEIN-BICK等[11]的研究結(jié)果(9%)。分析這2個(gè)研究結(jié)果的差異，原因是多方面的，但最重要的是樣本制備過程中使用了新的免洗溶血方法及CD45設(shè)門方法。自此，MACS下屬實(shí)驗(yàn)室均統(tǒng)一使用免洗溶血素和CD45設(shè)門方法，淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的CV因此可控制在較小的范圍內(nèi)。NIAID-IQA可接受標(biāo)準(zhǔn)為CD4+%和CD8+T細(xì)胞百分比項(xiàng)目室內(nèi)重復(fù)性CV≤3%，室間重復(fù)性CV<5%。而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法遠(yuǎn)未達(dá)到統(tǒng)一，即使參與上海市臨床檢驗(yàn)中心EQA活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室也未能統(tǒng)一使用免洗溶血素和CD45設(shè)門的檢測(cè)方法。

綜上所述，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和上海市臨床檢驗(yàn)中心的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)EQA的s和CV低于臨床實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控s和CV的情況存在不合理性，其原因可能是部分參與EQA的實(shí)驗(yàn)室在數(shù)據(jù)上報(bào)前對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了交流、核對(duì)和更改。針對(duì)這樣的情況，能夠采取的較為適合的措施除了加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量教育外，EQA組織者還需要探討建立更合適的質(zhì)控規(guī)則以及設(shè)計(jì)防串通方案。比如在EQA樣本準(zhǔn)備中，配置多于5個(gè)濃度水平的樣本，對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)選取不同濃度的組合；或?qū)?個(gè)不同濃度水平的樣本通過軟件將編號(hào)打亂發(fā)放等措施。

參考文獻(xiàn)

[1]MANDY FF, BERGERON M, MINKUS T. Evolution of leukocyte immunophenotyping as influenced by the HIV/AIDS pandemic: a short history of the development of gating strategies for CD4+ T-cell enumeration[J]. Cytometry,1997,30(4): 157-165.

[2]BARNETT D, GRANGER V, WHITBY L, et al. Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: the way forward [J]. Br J Haematol,1999,106(4): 1059-1062.

[3]ABOULKER JP, AUTRAN B, BELDJORD K, et al. Consistency of routine measurements of CD4+, CD8+ peripheral blood lymphocytes [J]. J Immunol Methods,1992,154(2): 155-161.

[4]GOGUEL AF, CRAINIC K, DUCAILAR A, et al. Interlaboratory quality assessment of lymphocyte phenotyping. Etalonorme 1990-1992 surveys [J]. Biol Cell,1993,78(1-2): 79-84.

[5]BARNETT D, GRANGER V, MAYR P, et al. Evaluation of a novel stable whole blood quality control material for lymphocyte subset analysis: results from the UK NEQAS immune monitoring scheme [J]. Cytometry,1996,26(3): 216-222.

[6]MANDY F, BERGERON M, HOULE G, et al. Impact of the international program for quality assessment and standardization for immunological measures relevant to HIV/AIDS: QASI [J]. Cytometry, 2002,50(2): 111-116.

[7]BAUDOUIN F, SARDA MN, GOGUEL A, et al. Multicenter study of reference stabilized human blood for lymphocyte immunophenotyping quality control in flow cytometry. GEIL [J].Cytometry,1999, 38(3): 127-132.

[8]LEVERING WHBM, VAN WIERINGEN WN, KRAAN J, et al. Flow cytometric lymphocyte subset enumeration: 10 years of external quality assessment in the Benelux countries [J]. Cytometry B Clin Cytom, 2008,74(2): 79-90.

[9]GLENCROSS DK, AGGETT HM, STEVENS WS, et al. African regional external quality assessment for CD4 T-cell enumeration: development, outcomes, and performance of laboratories [J]. Cytometry B Clin Cytom, 2008,74(Suppl 1): S69-S79.

[10]HULTIN LE, CHOW M, JAMIESON BD, et al. Comparison of interlaboratory variation in absolute T-cell counts by single-platform and optimized dual-platform methods [J].Cytometry B Clin Cytom, 2010,78(3): 194-200.

[11]SCHNIZLEIN-BICK CT, SPRITZLER J, WILKENING CL, et al. Evaluation of TruCOUNT absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site investigators nad the NIAID DAIDS new technolgies evaluation group[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2000,7(3): 336-343.

(本文編輯：龔曉霖)

關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)；室間質(zhì)量評(píng)價(jià)；標(biāo)準(zhǔn)差；變異系數(shù)

Analysis on the results of external quality assessment of lymphocyte subsets by flow cytometryZHUYuqing,ZHUJun,XUChong.(ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the assessment rationality scheme of external quality assessment (EQA) for the analysis of lymphocyte subsets by comparing the data from the lymphocyte subset EQA in the National Center for Clinical Laboratory and Shanghai Center for Clinical Laboratory and the submitted data of internal quality control from 2 laboratories in Shanghai, in order to improve the analysis quality of lymphocyte subsets. MethodsThe data of BD flow cytometry group from the National Center for Clinical Laboratory EQA in 2014 and Shanghai Center for Clinical Laboratory EQA for the first time in 2015 were analyzed statistically, and the standard deviation (s) and coefficient of variation (CV) were calculated. The internal quality control data from 2 laboratories in Shanghai were collected from September 2014 to April 2015, and the s and CV were calculated. The CD3+CD4+percentage (CD3+CD4+%) data of Sample 201403 and Sample 201405 (target values: 42.7% and 42.1%) from the National Center for Clinical Laboratory, Sample 1521 and Sample 1525 (target values: 43.2% and 44.13%) from Shanghai Center for Clinical Laboratory and the submitted internal quality control data (monthly mean 44.39%- 46.80%) of 2 laboratories were analyzed comparatively. ResultsThe s and CV of 5 EQA samples from the National Center for Clinical Laboratory in 2014 were 1.10%-1.55% and 3.1%-5.5%, respectively, and the average CV was 3.36%. The s and CV of 5 EQA samples for Shanghai Center for Clinical Laboratory in 2015 were 0.67%-1.63% and 3.51%-8.64%, respectively, and the average CV was 4.83%. In the situation of data with approximate means, the group s (1.55% and 1.35%) and group CV (3.6% and 3.2%) from the National Center for Clinical Laboratory and the group s (1.63% and 1.55%) and group CV (3.78% and 3.51%) from Shanghai Center for Clinical Laboratory were less than those of internal quality control data from 2 laboratories (monthly s1.06%-2.44% and 0.98%-2.03%; monthly CV 2.18%-5.28% and 2.14%-4.35%). ConclusionsIt is irrational that the s and CV of EQA are less than those of internal quality control since different impacts from the factors such as instrument brands and models, lysis techniques, brands and volumes of antibodies, gating strategies, experimenters and environment conditions and so on. One of the possible reasons may be that some laboratories exchanged, checked and sometime modified the EQA data before submitting the data. Other than improving the quality education for the laboratories, the solution can be the establishment of rational marking scheme.

Key words:Lymphocyte subset; Flow cytometry; External quality assessment; Standard deviation; Coefficient of variation

收稿日期：(2015-07-07)

作者簡(jiǎn)介：朱宇清，女，1967年生，碩士，副主任技師，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)及質(zhì)量控制研究。

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(2013ZYJB0010)

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)11-1086-05R446.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.007