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    ALT催化活性測定中不同廠家或批號試劑不確定度的評定

    2016-01-25 08:02:22顧文超,王惠民,季伙燕
    檢驗醫(yī)學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:一致性實驗室

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    ALT催化活性測定中不同廠家或批號試劑不確定度的評定

    國內(nèi)外不同參考實驗室對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)催化活性濃度的測定均使用國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)推薦的參考測量程序,但測量結(jié)果仍存在差異。每年參加國際參考實驗室間質(zhì)量評價(RELA)計劃[1]的國內(nèi)外參考實驗室達(dá)數(shù)十家,各參考實驗室相同樣本中ALT催化活性的測定結(jié)果都不盡相同,有些甚至存在較大差異[2]。我們旨在通過研究不同廠家或批號試劑對ALT催化活性濃度的影響,從而判斷試劑廠家或批號的不同是否是導(dǎo)致各參考實驗室對ALT測定結(jié)果產(chǎn)生差異的原因之一。同時,由于目前在不確定度評估中考慮不同廠家和批號試劑的文獻(xiàn)很少,我們通過比較不同廠家或批號L-丙氨酸、α-酮戊二酸、還原型btea-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate,NADH)和三羥甲基氨基甲烷(Tris hydroxyl methyl aminomethane,Tris)對ALT催化活性濃度的影響,評估由它們所引起的不確定度,篩選出較好的試劑廠家,作為參考實驗室評定測量結(jié)果不確定度時的參考。

    材料和方法

    一、標(biāo)本血清收集

    根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(the International Organization for Standardization,ISO)導(dǎo)則34[3],收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者混合新鮮血清,人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)均為陰性,共5個濃度水平(S1~S5),ALT濃度范圍分別為30~50 U/L(S1)、60~80 U/L(S2)、90~110 U/L(S3)、120~140 U/L(S4)、180~200 U/L(S5),并剔除溶血、黃疸、乳糜血標(biāo)本。

    二、主要試劑及儀器

    L-丙氨酸購自Sigma-Aldrich公司(簡稱Sigma公司,批號1為SLBF7656V、批號2為091M1228V)、蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司(簡稱為亞科公司,批號1為YK2013040701、批號2為YK2013072001)、東京化成工業(yè)株式會社(簡稱TCI公司,批號為WF8HE-BD)。Tris購自Sigma公司(批號1為SLBC3621V、批號2為SLBF5096V)、亞科公司(批號1為YK2013120501、批號2為YK2013110901)、TCI公司(批號為3VF5B-IF)。α-酮戊二酸購自Sigma公司(批號1為BCBC2051V、批號2為BCBK2005V)、亞科公司(批號1為YK2013101801、批號2為YK2013071501)、TCI公司(批號為MTQWG-EA)。NADH購自Sigma公司(批號1為SLBG3492V、批號2為SLBC9397V)、亞科公司(批號1為YK2013112501、批號2為YK2013122501)、TCI公司(批號為3MVMN-IN)。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)(批號099K7415V)、 5′-磷酸吡哆醛(批號SLBB2566V)、牛血清白蛋白均購自Sigma公司。Cary 4000紫外/可見分光光度儀(美國安捷倫公司);Hanna HI98183型pH酸度計(意大利哈納公司);Fluke 1521點式溫度計(美國福祿克公司);Sartorius BT25S電子天平(德國賽多利斯公司);DKB-501A型超級恒溫水槽(北京格瑞恩公司);5 000和200 μL Eppendorf Reference移液器各1支。

    三、方法

    對S1~S5共5個濃度水平的血清分別進行測定,每個廠家或批號的試劑分別測定S1~S5血清各5次,連續(xù)測定4 d。以不同廠家L-丙氨酸對ALT催化活性濃度影響為例,保持其他試劑3種成份不變(使用Sigma批號1試劑),分別改變L-丙氨酸的廠家和批號,配制試劑,進行ALT活性濃度的測定。

    參照IFCC推薦的ALT參考測量程序[4],在Cary 4000紫外/可見分光光度儀的反應(yīng)杯內(nèi)加入2.000 mL反應(yīng)液和0.200 mL混合血清標(biāo)本,完全混合并孵育300 s,在300 s末加入0.200 mL的起始反應(yīng)液,延滯90 s,測量180 s內(nèi)吸光度的變化率,計算ALT催化活性。

    四、統(tǒng)計學(xué)方法

    對參考方法所測結(jié)果采用MedCalc軟件進行Bland-Altman一致性分析[5]。Bland-Altman 分析法以2個不同廠家或批號試劑的平均值為橫坐標(biāo),以它們的差值為縱坐標(biāo),標(biāo)繪出散點圖[6],并以差值的均數(shù)(±1.96s)為95%的一致性界限,當(dāng)95%的點都在一致性區(qū)間內(nèi),且該變異范圍滿足臨床可接受范圍及平均偏倚低于IFCC參考方法允許變異范圍(5.25%)[7],則可以認(rèn)為這2種方法具有較好的一致性。

    不同廠家或批號試劑間的不確定度(u)計算參照單因素方差分析進行計算。

    擴展不確定度(U)=k×uc (k=2)

    結(jié)果

    一、不同廠家L-丙氨酸對ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家L-丙氨酸對ALT催化活性濃度的影響見表1。不同廠家或批號L-丙氨酸對ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見圖1。對于同一廠家不同批號的L-丙氨酸,Sigma公司2個批號與亞科公司2個批號對ALT催化活性濃度一致性好;對于不同廠家的L-丙氨酸,Sigma公司與TCI公司對ALT催化活性濃度一致性較好。不同廠家L-丙氨酸的u為0.9%。

    表1 不同廠家或批號L-丙氨酸測定ALT催化活性濃度

    圖1 不同廠家或批號L-丙氨酸對ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    二、不同廠家α-酮戊二酸對ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家α-酮戊二酸對ALT催化活性濃度的影響見表2。不同廠家或批號α-酮戊二酸對ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見圖2。對于同一廠家不同批號的α-酮戊二酸,Sigma公司2個批號對ALT催化活性濃度一致性好,亞科公司2個批號α-酮戊二酸對ALT催化活性濃度一致性較差;對于不同廠家的α-酮戊二酸,Sigma公司與TCI公司對ALT催化活性濃度一致性好。不同廠家α-酮戊二酸的u為0.65%。

    表2  不同廠家或批號α-酮戊二酸測定ALT催化活性濃度

    圖2 不同廠家或批號α-酮戊二酸對ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    三、不同廠家NADH對ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家NADH對ALT催化活性濃度的影響見表3。不同廠家或批號NADH對ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見圖3。對于同一廠家不同批號的NADH,Sigma公司2個批號與亞科公司2個批號對ALT催化活性濃度一致性好;對于不同廠家的NADH,3家公司對ALT催化活性濃度一致性均好。不同廠家NADH的u為0.58%。

    表3  不同廠家或批號NADH測定ALT催化活性濃度

    圖3  不同廠家或批號NADH對ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    四、不同廠家Tris對ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家Tris對ALT催化活性濃度的影響見表4。不同廠家或批號Tris對ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見圖4。對于同一廠家不同批號的Tris,Sigma公司2個批號和亞科公司2個批號對ALT催化活性濃度一致性好;對于不同廠家的Tris,Sigma公司及TCI公司對ALT催化活性濃度一致性均較好。不同廠家Tris的u為0.23%。

    表4  不同廠家或批號Tris測定ALT催化活性濃度

    圖4  不同廠家或批號Tris對ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    五、不同廠家或批號試劑不確定度評定結(jié)果

    ALT試劑各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同批號及不同廠家的u分別為0.90%、0.65%、0.58%、0.23% 。不同廠家或批號試劑對ALT催化活性濃度影響為:

    U=1.27×2=2.54%(k=2)

    討論

    本研究使用的Bland-Altman分析法是由BLAND等[8]于1986年提出的。它的基本思想是計算出2種測量結(jié)果差值的95%一致性界限。如果這個界限在臨床實際可接受的范圍內(nèi),則可以認(rèn)為這2種測量方法有較好的一致性,2種方法可以互換使用。反之還不能認(rèn)為2種方法可以互換。它解決了相關(guān)分析不能解決的問題,是一種評價2種測定方法結(jié)果一致性的科學(xué)、簡單、直觀的統(tǒng)計方法。

    本研究結(jié)果顯示,通過Bland-Altman一致性分析,在測定ALT催化活性濃度的過程中,同一廠家不同批號之間一致性較好,可互換使用;而對于不同廠家的試劑,實驗結(jié)果有一定的差異,因此實驗室如果在更換試劑廠家時應(yīng)對試劑進行評價,以保證實驗室結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

    不同廠家或批號試劑對ALT催化活性濃度影響的uc為1.27%,U為2.54%(k=2)。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),目前針對不同廠家或批號試劑所引起的不確定度方面研究較少,其中德國臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)協(xié)會參考實驗室2提供的不同試劑批號引起的不確定度為1.5%,與本研究結(jié)果有一定差異。其原因是本研究在考慮不同批號試劑的基礎(chǔ)上增加了不同廠家試劑之間的差異。

    在國際RELA比對試驗中,各參考實驗室間對同一樣本所測得ALT催化活性濃度存在較大差異(見圖5和圖6)[2],試劑廠家或批號不同是原因之一。因此,為了使各參加RELA比對的參考實驗室和候選參考實驗室對ALT催化活性濃度測定的結(jié)果更具可比性和一致性,應(yīng)規(guī)定所使用的各種試劑的廠家。

    圖5 2013年低值A(chǔ)LT催化活性濃度測定RELA比對結(jié)果

    圖6 2013年低值A(chǔ)LT催化活性濃度測定RELA比對結(jié)果

    在今后的研究中,我們將分析不同廠家試劑對ALT催化活性濃度影響的原因,是否為雜質(zhì)影響(雜質(zhì)存在抑制劑或激活劑等),同時進行長期實驗,增加更多的試劑廠家和批號,累積更多的實驗數(shù)據(jù),為參考實驗室評定測量結(jié)果不確定度提供參考。

    參考文獻(xiàn)

    [1]遲珊,沈默,張曼. γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶國際室間比對計劃結(jié)果分析[J].檢驗醫(yī)學(xué),2011,26(8):540-543.

    [2]International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. RELA -- IFCC external quality assessment scheme for reference laboratories in laboratory medicine[EB/OL]. (2015-01-14)[2015-01-14]. http://www.dgkl-rfb.de:81/.

    [3]International Organization for Standardization. General requirements for the competence of reference material producers[S].ISO Guide 34,ISO,2009.

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    [5]LUDBROOK J. Confidence in Altman-Bland plots: a critical review of the method of differences[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(2):143-149.

    [6]陳卉.Bland-Altman分析在臨床測量方法一致性評價中的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計,2007,24(3): 308-309.

    [7]陳寶榮,孫慧穎,邵燕,等.四種血清a-淀粉酶廠家系統(tǒng)測量結(jié)果的正確性評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(4):309-316.

    [8]BLAND JM,ALTMAN DG.Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement[J] . Lancet,1986,1(8476): 307-310.

    (本文編輯:龔曉霖)

    顧文超1,王惠民1,季伙燕1, 王建新2,張衛(wèi)威1,孟舒婷1,許麗麗1

    (1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇 南通 226001;2.南通大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)研究所,江蘇 南通 226001)

    摘要:目的研究不同廠家或同一廠家不同批號的L-丙氨酸、α-酮戊二酸、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(NADH)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)對丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)催化活性濃度的影響,評定ALT催化活性測定中不同廠家或批號試劑不確定度。方法按照國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會推薦的ALT參考測量程序(37 ℃),分別測定S1~S5共5個濃度水平血清,用Bland-Altman法分析其一致性,并計算不同廠家或批號試劑間的不確定度。結(jié)果ALT試劑各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同廠家及批號的不確定度分別為0.90%、0.65%、0.58%、0.23%,對ALT催化活性濃度影響的擴展不確定度為2.54%(k=2)。結(jié)論要使各參考實驗室所測定的ALT催化活性濃度結(jié)果更具可比性,應(yīng)規(guī)定各使用試劑廠家及批號,并在不確定度評定中考慮不同廠家或批號試劑的不確定度。

    關(guān)鍵詞:不確定度;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;催化活性;L-丙氨酸;α-酮戊二酸;還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽;三羥甲基氨基甲烷

    Estimation on the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbersGUWenchao1,WANGHuimin1,JIHuoyan1 ,WANGJianxin2,ZHANGWeiwei1,MENGShuting1,XULili1.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China; 2.TheLaboratoryMedicineInstituteofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China)

    Abstract:ObjectiveTo research the influence of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate(NADH) and Tris hydroxyl methyl aminomethane(Tris) coming from different manufacturers or different lot numbers on alanine aminotransferase (ALT) catalytic activity, and to evaluate the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbers. MethodsThe sera with 5 concentrations(S1-S5) were measured by the reference method (37 ℃) recommended by the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. The consistency was analyzed by Bland-Altman method, and the uncertainties of ALT with different manufacturers or lot numbers were calculated. ResultsThe uncertainties of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, NADH and Tris were 0.90%, 0.65%, 0.58% and 0.23%. The expanded uncertainties of different manufacturers or lot numbers of reagents were 2.54%(k=2). ConclusionsIt is supposed to define every reagent manufacturer and lot number to make ALT catalytic activity measured by reference laboratories more comparable. When evaluating the uncertainty, we should consider the influence of reagents with different manufacturers or different lot numbers.

    Key words:Uncertainty;Alanine aminotransferase;Catalytic activity;L-alanine;Alpha-ketoglutaric acid;Beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate;Tris hydroxyl methyl aminomethane

    收稿日期:(2015-01-15)

    通訊作者:王惠民,聯(lián)系方式:0513-85052102。

    作者簡介:顧文超,女,1989年生,學(xué)士,主要從事酶學(xué)及生物化學(xué)檢驗工作。

    基金項目:國家質(zhì)檢總局資助項目(201210066)

    中圖分類號:

    文章編號:1673-8640(2015)11-1150-07R446.1

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:ADOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.021

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