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    ALT催化活性測(cè)定中不同廠家或批號(hào)試劑不確定度的評(píng)定

    2016-01-25 08:02:22顧文超,王惠民,季伙燕
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:一致性實(shí)驗(yàn)室

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    ALT催化活性測(cè)定中不同廠家或批號(hào)試劑不確定度的評(píng)定

    國(guó)內(nèi)外不同參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)催化活性濃度的測(cè)定均使用國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)推薦的參考測(cè)量程序,但測(cè)量結(jié)果仍存在差異。每年參加國(guó)際參考實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(RELA)計(jì)劃[1]的國(guó)內(nèi)外參考實(shí)驗(yàn)室達(dá)數(shù)十家,各參考實(shí)驗(yàn)室相同樣本中ALT催化活性的測(cè)定結(jié)果都不盡相同,有些甚至存在較大差異[2]。我們旨在通過(guò)研究不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)ALT催化活性濃度的影響,從而判斷試劑廠家或批號(hào)的不同是否是導(dǎo)致各參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)ALT測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生差異的原因之一。同時(shí),由于目前在不確定度評(píng)估中考慮不同廠家和批號(hào)試劑的文獻(xiàn)很少,我們通過(guò)比較不同廠家或批號(hào)L-丙氨酸、α-酮戊二酸、還原型btea-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate,NADH)和三羥甲基氨基甲烷(Tris hydroxyl methyl aminomethane,Tris)對(duì)ALT催化活性濃度的影響,評(píng)估由它們所引起的不確定度,篩選出較好的試劑廠家,作為參考實(shí)驗(yàn)室評(píng)定測(cè)量結(jié)果不確定度時(shí)的參考。

    材料和方法

    一、標(biāo)本血清收集

    根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(the International Organization for Standardization,ISO)導(dǎo)則34[3],收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院健康體檢者混合新鮮血清,人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)均為陰性,共5個(gè)濃度水平(S1~S5),ALT濃度范圍分別為30~50 U/L(S1)、60~80 U/L(S2)、90~110 U/L(S3)、120~140 U/L(S4)、180~200 U/L(S5),并剔除溶血、黃疸、乳糜血標(biāo)本。

    二、主要試劑及儀器

    L-丙氨酸購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(簡(jiǎn)稱Sigma公司,批號(hào)1為SLBF7656V、批號(hào)2為091M1228V)、蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司(簡(jiǎn)稱為亞科公司,批號(hào)1為YK2013040701、批號(hào)2為YK2013072001)、東京化成工業(yè)株式會(huì)社(簡(jiǎn)稱TCI公司,批號(hào)為WF8HE-BD)。Tris購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)1為SLBC3621V、批號(hào)2為SLBF5096V)、亞科公司(批號(hào)1為YK2013120501、批號(hào)2為YK2013110901)、TCI公司(批號(hào)為3VF5B-IF)。α-酮戊二酸購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)1為BCBC2051V、批號(hào)2為BCBK2005V)、亞科公司(批號(hào)1為YK2013101801、批號(hào)2為YK2013071501)、TCI公司(批號(hào)為MTQWG-EA)。NADH購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)1為SLBG3492V、批號(hào)2為SLBC9397V)、亞科公司(批號(hào)1為YK2013112501、批號(hào)2為YK2013122501)、TCI公司(批號(hào)為3MVMN-IN)。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)(批號(hào)099K7415V)、 5′-磷酸吡哆醛(批號(hào)SLBB2566V)、牛血清白蛋白均購(gòu)自Sigma公司。Cary 4000紫外/可見(jiàn)分光光度儀(美國(guó)安捷倫公司);Hanna HI98183型pH酸度計(jì)(意大利哈納公司);Fluke 1521點(diǎn)式溫度計(jì)(美國(guó)福祿克公司);Sartorius BT25S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽(北京格瑞恩公司);5 000和200 μL Eppendorf Reference移液器各1支。

    三、方法

    對(duì)S1~S5共5個(gè)濃度水平的血清分別進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)廠家或批號(hào)的試劑分別測(cè)定S1~S5血清各5次,連續(xù)測(cè)定4 d。以不同廠家L-丙氨酸對(duì)ALT催化活性濃度影響為例,保持其他試劑3種成份不變(使用Sigma批號(hào)1試劑),分別改變L-丙氨酸的廠家和批號(hào),配制試劑,進(jìn)行ALT活性濃度的測(cè)定。

    參照IFCC推薦的ALT參考測(cè)量程序[4],在Cary 4000紫外/可見(jiàn)分光光度儀的反應(yīng)杯內(nèi)加入2.000 mL反應(yīng)液和0.200 mL混合血清標(biāo)本,完全混合并孵育300 s,在300 s末加入0.200 mL的起始反應(yīng)液,延滯90 s,測(cè)量180 s內(nèi)吸光度的變化率,計(jì)算ALT催化活性。

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    對(duì)參考方法所測(cè)結(jié)果采用MedCalc軟件進(jìn)行Bland-Altman一致性分析[5]。Bland-Altman 分析法以2個(gè)不同廠家或批號(hào)試劑的平均值為橫坐標(biāo),以它們的差值為縱坐標(biāo),標(biāo)繪出散點(diǎn)圖[6],并以差值的均數(shù)(±1.96s)為95%的一致性界限,當(dāng)95%的點(diǎn)都在一致性區(qū)間內(nèi),且該變異范圍滿足臨床可接受范圍及平均偏倚低于IFCC參考方法允許變異范圍(5.25%)[7],則可以認(rèn)為這2種方法具有較好的一致性。

    不同廠家或批號(hào)試劑間的不確定度(u)計(jì)算參照單因素方差分析進(jìn)行計(jì)算。

    擴(kuò)展不確定度(U)=k×uc (k=2)

    結(jié)果

    一、不同廠家L-丙氨酸對(duì)ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家L-丙氨酸對(duì)ALT催化活性濃度的影響見(jiàn)表1。不同廠家或批號(hào)L-丙氨酸對(duì)ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)于同一廠家不同批號(hào)的L-丙氨酸,Sigma公司2個(gè)批號(hào)與亞科公司2個(gè)批號(hào)對(duì)ALT催化活性濃度一致性好;對(duì)于不同廠家的L-丙氨酸,Sigma公司與TCI公司對(duì)ALT催化活性濃度一致性較好。不同廠家L-丙氨酸的u為0.9%。

    表1 不同廠家或批號(hào)L-丙氨酸測(cè)定ALT催化活性濃度

    圖1 不同廠家或批號(hào)L-丙氨酸對(duì)ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    二、不同廠家α-酮戊二酸對(duì)ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家α-酮戊二酸對(duì)ALT催化活性濃度的影響見(jiàn)表2。不同廠家或批號(hào)α-酮戊二酸對(duì)ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)于同一廠家不同批號(hào)的α-酮戊二酸,Sigma公司2個(gè)批號(hào)對(duì)ALT催化活性濃度一致性好,亞科公司2個(gè)批號(hào)α-酮戊二酸對(duì)ALT催化活性濃度一致性較差;對(duì)于不同廠家的α-酮戊二酸,Sigma公司與TCI公司對(duì)ALT催化活性濃度一致性好。不同廠家α-酮戊二酸的u為0.65%。

    表2  不同廠家或批號(hào)α-酮戊二酸測(cè)定ALT催化活性濃度

    圖2 不同廠家或批號(hào)α-酮戊二酸對(duì)ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    三、不同廠家NADH對(duì)ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家NADH對(duì)ALT催化活性濃度的影響見(jiàn)表3。不同廠家或批號(hào)NADH對(duì)ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)于同一廠家不同批號(hào)的NADH,Sigma公司2個(gè)批號(hào)與亞科公司2個(gè)批號(hào)對(duì)ALT催化活性濃度一致性好;對(duì)于不同廠家的NADH,3家公司對(duì)ALT催化活性濃度一致性均好。不同廠家NADH的u為0.58%。

    表3  不同廠家或批號(hào)NADH測(cè)定ALT催化活性濃度

    圖3  不同廠家或批號(hào)NADH對(duì)ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    四、不同廠家Tris對(duì)ALT催化活性濃度的影響

    不同廠家Tris對(duì)ALT催化活性濃度的影響見(jiàn)表4。不同廠家或批號(hào)Tris對(duì)ALT催化活性濃度影響的Bland-Altman一致性分析結(jié)果見(jiàn)圖4。對(duì)于同一廠家不同批號(hào)的Tris,Sigma公司2個(gè)批號(hào)和亞科公司2個(gè)批號(hào)對(duì)ALT催化活性濃度一致性好;對(duì)于不同廠家的Tris,Sigma公司及TCI公司對(duì)ALT催化活性濃度一致性均較好。不同廠家Tris的u為0.23%。

    表4  不同廠家或批號(hào)Tris測(cè)定ALT催化活性濃度

    圖4  不同廠家或批號(hào)Tris對(duì)ALT催化活性濃度影響一致性的Bland-Altman圖

    五、不同廠家或批號(hào)試劑不確定度評(píng)定結(jié)果

    ALT試劑各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同批號(hào)及不同廠家的u分別為0.90%、0.65%、0.58%、0.23% 。不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)ALT催化活性濃度影響為:

    U=1.27×2=2.54%(k=2)

    討論

    本研究使用的Bland-Altman分析法是由BLAND等[8]于1986年提出的。它的基本思想是計(jì)算出2種測(cè)量結(jié)果差值的95%一致性界限。如果這個(gè)界限在臨床實(shí)際可接受的范圍內(nèi),則可以認(rèn)為這2種測(cè)量方法有較好的一致性,2種方法可以互換使用。反之還不能認(rèn)為2種方法可以互換。它解決了相關(guān)分析不能解決的問(wèn)題,是一種評(píng)價(jià)2種測(cè)定方法結(jié)果一致性的科學(xué)、簡(jiǎn)單、直觀的統(tǒng)計(jì)方法。

    本研究結(jié)果顯示,通過(guò)Bland-Altman一致性分析,在測(cè)定ALT催化活性濃度的過(guò)程中,同一廠家不同批號(hào)之間一致性較好,可互換使用;而對(duì)于不同廠家的試劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異,因此實(shí)驗(yàn)室如果在更換試劑廠家時(shí)應(yīng)對(duì)試劑進(jìn)行評(píng)價(jià),以保證實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。

    不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)ALT催化活性濃度影響的uc為1.27%,U為2.54%(k=2)。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),目前針對(duì)不同廠家或批號(hào)試劑所引起的不確定度方面研究較少,其中德國(guó)臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)參考實(shí)驗(yàn)室2提供的不同試劑批號(hào)引起的不確定度為1.5%,與本研究結(jié)果有一定差異。其原因是本研究在考慮不同批號(hào)試劑的基礎(chǔ)上增加了不同廠家試劑之間的差異。

    在國(guó)際RELA比對(duì)試驗(yàn)中,各參考實(shí)驗(yàn)室間對(duì)同一樣本所測(cè)得ALT催化活性濃度存在較大差異(見(jiàn)圖5和圖6)[2],試劑廠家或批號(hào)不同是原因之一。因此,為了使各參加RELA比對(duì)的參考實(shí)驗(yàn)室和候選參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)ALT催化活性濃度測(cè)定的結(jié)果更具可比性和一致性,應(yīng)規(guī)定所使用的各種試劑的廠家。

    圖5 2013年低值A(chǔ)LT催化活性濃度測(cè)定RELA比對(duì)結(jié)果

    圖6 2013年低值A(chǔ)LT催化活性濃度測(cè)定RELA比對(duì)結(jié)果

    在今后的研究中,我們將分析不同廠家試劑對(duì)ALT催化活性濃度影響的原因,是否為雜質(zhì)影響(雜質(zhì)存在抑制劑或激活劑等),同時(shí)進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn),增加更多的試劑廠家和批號(hào),累積更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為參考實(shí)驗(yàn)室評(píng)定測(cè)量結(jié)果不確定度提供參考。

    參考文獻(xiàn)

    [1]遲珊,沈默,張曼. γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶國(guó)際室間比對(duì)計(jì)劃結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,26(8):540-543.

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    [6]陳卉.Bland-Altman分析在臨床測(cè)量方法一致性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì),2007,24(3): 308-309.

    [7]陳寶榮,孫慧穎,邵燕,等.四種血清a-淀粉酶廠家系統(tǒng)測(cè)量結(jié)果的正確性評(píng)價(jià)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(4):309-316.

    [8]BLAND JM,ALTMAN DG.Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement[J] . Lancet,1986,1(8476): 307-310.

    (本文編輯:龔曉霖)

    顧文超1,王惠民1,季伙燕1, 王建新2,張衛(wèi)威1,孟舒婷1,許麗麗1

    (1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 南通 226001;2.南通大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,江蘇 南通 226001)

    摘要:目的研究不同廠家或同一廠家不同批號(hào)的L-丙氨酸、α-酮戊二酸、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(NADH)和三羥甲基氨基甲烷(Tris)對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)催化活性濃度的影響,評(píng)定ALT催化活性測(cè)定中不同廠家或批號(hào)試劑不確定度。方法按照國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦的ALT參考測(cè)量程序(37 ℃),分別測(cè)定S1~S5共5個(gè)濃度水平血清,用Bland-Altman法分析其一致性,并計(jì)算不同廠家或批號(hào)試劑間的不確定度。結(jié)果ALT試劑各成分(L-丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH、Tris)不同廠家及批號(hào)的不確定度分別為0.90%、0.65%、0.58%、0.23%,對(duì)ALT催化活性濃度影響的擴(kuò)展不確定度為2.54%(k=2)。結(jié)論要使各參考實(shí)驗(yàn)室所測(cè)定的ALT催化活性濃度結(jié)果更具可比性,應(yīng)規(guī)定各使用試劑廠家及批號(hào),并在不確定度評(píng)定中考慮不同廠家或批號(hào)試劑的不確定度。

    關(guān)鍵詞:不確定度;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;催化活性;L-丙氨酸;α-酮戊二酸;還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽;三羥甲基氨基甲烷

    Estimation on the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbersGUWenchao1,WANGHuimin1,JIHuoyan1 ,WANGJianxin2,ZHANGWeiwei1,MENGShuting1,XULili1.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China; 2.TheLaboratoryMedicineInstituteofNantongUniversity,JiangsuNantong226001,China)

    Abstract:ObjectiveTo research the influence of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate(NADH) and Tris hydroxyl methyl aminomethane(Tris) coming from different manufacturers or different lot numbers on alanine aminotransferase (ALT) catalytic activity, and to evaluate the uncertainty of ALT catalytic activity with different manufacturers or different lot numbers. MethodsThe sera with 5 concentrations(S1-S5) were measured by the reference method (37 ℃) recommended by the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. The consistency was analyzed by Bland-Altman method, and the uncertainties of ALT with different manufacturers or lot numbers were calculated. ResultsThe uncertainties of L-alanine, alpha-ketoglutaric acid, NADH and Tris were 0.90%, 0.65%, 0.58% and 0.23%. The expanded uncertainties of different manufacturers or lot numbers of reagents were 2.54%(k=2). ConclusionsIt is supposed to define every reagent manufacturer and lot number to make ALT catalytic activity measured by reference laboratories more comparable. When evaluating the uncertainty, we should consider the influence of reagents with different manufacturers or different lot numbers.

    Key words:Uncertainty;Alanine aminotransferase;Catalytic activity;L-alanine;Alpha-ketoglutaric acid;Beta-nicotinamide adenine dinucleotide reduced disodium salt hydrate;Tris hydroxyl methyl aminomethane

    收稿日期:(2015-01-15)

    通訊作者:王惠民,聯(lián)系方式:0513-85052102。

    作者簡(jiǎn)介:顧文超,女,1989年生,學(xué)士,主要從事酶學(xué)及生物化學(xué)檢驗(yàn)工作。

    基金項(xiàng)目:國(guó)家質(zhì)檢總局資助項(xiàng)目(201210066)

    中圖分類號(hào):

    文章編號(hào):1673-8640(2015)11-1150-07R446.1

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:ADOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2015.11.021

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