等溫滴定量熱法在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用

黃妍，張迎慶

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068)

等溫滴定量熱法在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用

黃妍，張迎慶Δ

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068)

分子印跡技術(shù)是一種制備對特定分子有特異性結(jié)合能力聚合物的新興技術(shù)，近年來受到廣泛關(guān)注。本文即對等溫滴定微量熱法在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用做一綜述，介紹微量熱法的基本原理、特點(diǎn)，以及其應(yīng)用于評價分子印跡聚合物的印跡效果、篩選單體和交聯(lián)劑、優(yōu)化反應(yīng)條件等方面的研究進(jìn)展。

分子印跡；等溫滴定微量熱法；篩選；優(yōu)化反應(yīng)條件

近年來不斷發(fā)展的分子印跡技術(shù)得到人們的普遍關(guān)注，并且其在制備、理論以及應(yīng)用方面都取得了較大的進(jìn)展。但即使如此，分子印跡技術(shù)仍存在著一些難點(diǎn)，例如，制備分子印跡聚合物時功能單體和交聯(lián)劑的選擇以及采用的聚合方法都具有一定的局限性，由于研究方法和手段較為單一，分子印跡過程和分子識別過程機(jī)理的探究還比較欠缺。等溫滴定微量熱法根據(jù)反應(yīng)體系的熱量變化測得的熱力學(xué)參數(shù)，可以分析反應(yīng)過程中的變化和反應(yīng)性質(zhì)，并且靈敏度高，對微小的熱量變化同樣非常敏感，因此該法不僅廣泛應(yīng)用于小分子、蛋白質(zhì)等[1-4]生物分子間的相互作用，還可用于研究分子印跡聚合過程的中分子間相互作用，進(jìn)而可以評價分子印跡聚合物的印跡效果。本文綜述了近年來等溫滴定微量法在分子印跡技術(shù)中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 分子印跡技術(shù)概述

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinting technology，MIT)是以某種分子為模板，制備對模板分子具有選擇性識別并對其有結(jié)合能力的聚合物的技術(shù)，所制備的聚合物稱為分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。印跡過程模仿了抗原-抗體的反應(yīng)機(jī)理，在印跡材料中引入特異性識別位點(diǎn)：模板分子與功能單體相互作用后在交聯(lián)劑作用下發(fā)生聚合，形成聚合物，在一定條件下除去模板分子后，可得到MIPs。MIPs是一種高穩(wěn)定性的聚合物，對高溫、高壓和較大的酸堿變化有一定的耐受性，且制備簡單、成本低、不易被生物降解、可重復(fù)利用[5]，同時還具有在三維空間上與模板分子匹配的空穴和由功能單體形成的特定識別位點(diǎn)，專一性強(qiáng)，這使它成為識別元件的最佳選擇[6]。因此，這類聚合物在分離提純[7]、化學(xué)傳感[8]、環(huán)境監(jiān)測[9]、膜分離[10]等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

分子印跡聚合物的制備方法可以按照單體與模板分子結(jié)合方式的不同，分為共價法和非共價法2種基本方法。在共價印跡中，功能單體和模板分子通過共價鍵結(jié)合形成復(fù)合物，聚合后脫去模板分子。這種方法能在印跡聚合物中形成良好的模板分子的空間結(jié)構(gòu)，但形成聚合的時間長，模板分子不易洗脫，難以達(dá)到熱力學(xué)平衡，不適于快速識別[11]；在非共價印跡中，單體通過非共價作用如金屬螯合作用、氫鍵、范德華力及疏水性相互作用等與模板分子相結(jié)合，不僅可以供給模板分子更多的相互作用，提高結(jié)合率，還可以減少干擾物對聚合物的非特異性結(jié)合[12]。

由于生物大分子體積龐大、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)都比較復(fù)雜，含有更多的結(jié)合位點(diǎn)，所以對于生物大分子印跡聚合物，不僅要在合成過程中考慮生物大分子的特殊性，選擇功能單體與交聯(lián)劑及聚合的條件，確保生物大分子的構(gòu)象完整和生物活性不被破壞，而且要考慮生物大分子表面眾多的結(jié)合位點(diǎn)，可能會導(dǎo)致印跡聚合物產(chǎn)生較多的非特異性吸附的問題。同時生物大分子巨大的體積使聚合物上的模板分子難以洗脫，所以生物大分子印跡聚合物的制備要求比小分子聚合物更高。因此目前分子印跡技術(shù)在小分子印跡方面的應(yīng)用較多，而在大分子印跡方面的應(yīng)用還比較少。目前，生物大分子的印跡技術(shù)方法主要有包埋法[13]、表面印跡法[14-15]和抗原決定基法[16]。

分子印跡聚合物的表征和印跡效果的評價方法據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域的不同各不相同。常采用傅里葉紅外光譜[17]、掃描電鏡[18]或質(zhì)譜、核磁共振[19]等對印跡聚合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。采用紫外光譜[20]和高效液相色譜[21]等方法，利用保留時間tR、結(jié)合常數(shù)Kb、分離因子α、分離度Rs、離解常數(shù)Ka、富集常數(shù)等，來測定分子印跡聚合物對模板的選擇吸附能力。但是這些印跡效果評價方法對于相互作用較弱的印跡識別誤差較大，且用于印跡識別行為研究時較為繁瑣。

2 等溫滴定量熱技術(shù)原理及特點(diǎn)

任何變化都存在著熱效應(yīng)。等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry，ITC)技術(shù)是一種新穎有效的熱分析技術(shù)，能對反應(yīng)中的熱效應(yīng)進(jìn)行精確的測定，并獲得一系列準(zhǔn)確的熱力學(xué)參數(shù)，根據(jù)這些參數(shù)的變化可以分析反應(yīng)過程。

2.1 等溫滴定微量熱法的基本原理 等溫滴定微量熱法采用功率補(bǔ)償?shù)脑?，直接測量反應(yīng)的熱變化[22]。該方法先將量熱池中的反應(yīng)體系維持在恒溫狀態(tài)后再進(jìn)行反應(yīng)和監(jiān)測。滴定前，儀器中的2個量熱池——樣品池和參比池處于相同的預(yù)設(shè)溫度，2者通過絕熱裝置隔開。在恒定溫度下，加樣針以一定速度向樣品池中滴加客體分子。當(dāng)客體分子進(jìn)入樣品池后，因反應(yīng)而產(chǎn)生的熱量變化使體系的溫度發(fā)生改變，從而導(dǎo)致樣品池與參比池之間存在溫度差。此時量熱池中的熱敏傳感器將檢測到的熱量差異信號傳遞給功率補(bǔ)償裝置，該裝置會對樣品池進(jìn)行熱量補(bǔ)償，使參比池的溫度與樣品池一致，即ΔT=0。隨著滴定過程的進(jìn)行，等溫滴定微量熱儀會記錄隨時間所提供的熱量大小并通過計算機(jī)放大后輸出。當(dāng)樣品池中反應(yīng)物的結(jié)合位點(diǎn)被樣品分子完全占據(jù)，熱效應(yīng)也隨之逐漸減小，補(bǔ)償功率值趨于平穩(wěn)，表明滴定結(jié)束[23]。根據(jù)熱量峰的曲線形狀選擇合適的模型進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，處理后可得到反應(yīng)平衡時的焓變(ΔH)，通過ΔH可計算出平衡常數(shù)、反應(yīng)的自由能(ΔG)和熵變(ΔS)。公式如下[24]。

ΔG=-RTlnk

(1)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(2)

2.2 等溫滴定微量熱法的特點(diǎn) 等溫滴定量熱技術(shù)是一種直接測量反應(yīng)體系中放出或吸收熱量的技術(shù)，具有高靈敏度、自動化、微量化的特點(diǎn)，檢測靈敏度可達(dá)0.1 μW。它對被研究體系的溶劑性質(zhì)等沒有任何限制條件，具有非特異性，并且在測量中無需添加任何試劑，直接檢測反應(yīng)過程，不會引入干擾因素。研究者只需設(shè)置好實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量即可由計算機(jī)來連續(xù)準(zhǔn)確地檢測各種熱效應(yīng)，并通過量熱曲線記錄反應(yīng)的變化過程。通過對體系中熱量變化的測定可以得到精確的結(jié)合常數(shù)(K)、反應(yīng)化學(xué)計量數(shù)(n)、熵(ΔS)、焓(ΔH)等有關(guān)分子間相互作用的完整信息。最后，在微量熱實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，被研究對象沒有任何損壞,樣品還可以做進(jìn)一步的分析測試研究。

3 等溫滴定微量熱技術(shù)在分子印跡中的應(yīng)用

等溫滴定微量熱技術(shù)可以直接表征分子間相互作用的熱力學(xué)驅(qū)動力。由于其可測得的熱變化極其微小并且靈敏，已經(jīng)成為鑒定分子間弱相互作用不可缺少的實(shí)驗(yàn)手段。分子印跡的反應(yīng)過程也會產(chǎn)生熱量的變化，例如模板分子和配位體的鍵合以及客體分子和印跡聚合物的相互作用等，都可以采用等溫滴定微量熱法從反應(yīng)熱的角度進(jìn)行分析研究，其應(yīng)用領(lǐng)域主要有以下幾方面。

3.1 等溫滴定微量熱技術(shù)用于印跡效果的評價 等溫滴定微量熱技術(shù)多用于測定分子印跡聚合物的印跡效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)熱譜圖，可以得出滴定終點(diǎn)和反應(yīng)過程中的焓變，求出吉布斯函數(shù)來測定反應(yīng)過程中的相互作用。

Lei等[25-26]以馬來松香酯為交聯(lián)劑，鹽酸小檗堿為模板，甲基丙烯酸為功能單體用懸浮法制備了含有菲骨架的分子印跡聚合物。通過高效液相色譜檢測分子印跡聚物的選擇識別的特性，并用微量熱法檢測了吸附過程。經(jīng)Scatchard分析，發(fā)現(xiàn)聚合物有2種不同的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)分別為kd1=0.020 4 mol/L和kd1=0.050 7 mol/L，表現(xiàn)為吸附過程的熱流量曲線出現(xiàn)一個吸熱峰和2個相對薄弱的放熱峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種分子印跡聚合物對鹽酸小檗堿具有高親和性和選擇性。隨后又制備了以延胡索乙素為模板的分子印跡聚合物和非印跡聚合物。采用掃描電鏡和氮吸附和熱分析進(jìn)行研究，量熱曲線表明印跡聚合物比非印跡聚合物對延胡索乙素的選擇性高。

3.2 等溫滴定微量熱技術(shù)用于篩選單體和交聯(lián)劑 通常，可用微量熱法測定單體和模板分子之間的相互作用[10]。選用不同的單體和交聯(lián)劑與模板分子結(jié)合，通過微量熱法測定，根據(jù)相互作用熱效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以篩選出合適的單體和交聯(lián)劑。Lin等[27]用微接觸印跡法制備高親和性的蛋白質(zhì)印跡聚合物膜,根據(jù)分子間相互作用釋放的熱量差異，通過微量熱法探究與模板蛋白相互作用的最佳交聯(lián)功能單體。微量熱研究表明四甘醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)對溶菌酶為模板分子時結(jié)合的選擇性最高，2種分子間相互作用釋放的平衡熱效應(yīng)值ΔQ為(54.4±1.78)mJ，而核糖核酸酶A和肌紅蛋白酶的交聯(lián)單體選用聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯(PEG400DMA)較好，單體與模板分子之間相互作用平衡熱效應(yīng)值ΔQ分別為(76.5±7.15)mJ和(463.36±17.76)mJ。同時，根據(jù)功能單體與模板分子間相互結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到苯乙烯單體對溶菌酶和核酸酶有著最高的熱效應(yīng)值，而甲基丙烯酸甲酯(MMA)，相對其它功能單體，能與肌紅蛋白酶有著更好地結(jié)合。

通過微量熱法得到的一系列參數(shù)反映出的印跡效果還可以研究模板分子、單體和交聯(lián)劑之間的最佳配比。Fish等[28]用等溫滴定微量熱法探究了辛可尼丁分子印跡聚合物中最佳的單體濃度。他們用甲基丙烯酸作為功能單體滴定辛可尼丁，結(jié)果表明，當(dāng)單體與模板分子的摩爾比為4:1時，甲基丙烯酸與辛可尼丁的氫鍵結(jié)合所需的能量ΔHf最小，用這個比例合成的MIP表現(xiàn)出對辛可尼丁的選擇性最好。這進(jìn)一步說明在聚合過程中，單體與模板比例平衡有利于聚合過程中的氫鍵與模板相互作用。但要注意減少多余單體的使用以降低聚合物的非特異性。

Chen等[29]在用微接觸印跡法制備肌酸激酶印跡分子中，從減少非特異性結(jié)合入手，對功能單體進(jìn)行篩選。將微量熱法與ELISA法相結(jié)合，最終選用PEG400DMA為交聯(lián)劑，甲基丙烯酸做功能單體，并且當(dāng)印跡材料上使用的肌酸激酶的量為2.05×10-10mol/cm2，交聯(lián)劑與功能單體用量比為1:19時，制備得出的分子印跡聚合物具有最佳的識別效果。Hsu等[30]利用等溫滴定微量熱法來設(shè)計不同靶蛋白的分子印跡聚合物的構(gòu)建。他們將苯乙烯作為單體，與PEG400DMA在不同比例下合成MIP。根據(jù)等溫滴定微量熱法得出，該聚合物重新結(jié)合核糖核酸酶A的反應(yīng)多為放熱反應(yīng)，苯乙烯作為功能單體，與功能單體相比較，能使MIP對核糖核酸酶A具有更高的親和性。并且在25 ℃下，苯乙烯與PEG400DMA的最佳體積比為20:100時，所得聚合物與模板蛋白結(jié)合放出的熱量最大，可以得到MIP結(jié)合核糖核酸酶A的最大印跡效率。

由于傳統(tǒng)分子印跡聚合物的親和性較低，為改善這一缺陷，Zhang等[31]采用DNA適配體作為大分子單體來改進(jìn)MIPs的性能。腺苷的DNA適配體被裂解成兩半之后，將其中一條單鏈用熒光標(biāo)記后使之聚合到分子印跡聚合物中。所得MIPs的親和結(jié)合率是無適配體片段混合物的2倍。等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)中，用腺苷滴定含有DNA單鏈片段的混合液時幾乎沒有檢測到熱量變化，而滴定MIPs時，產(chǎn)生的ΔH變化是裂解的DNA單鏈混合液的18倍。因此相較于含有裂解DNA片段的混合液，聚合了DNA單鏈的MIPs對與該DNA單鏈互補(bǔ)的腺苷更具親和性，進(jìn)一步將DNA裂解液中的單鏈片段縮短到6個核苷酸的長度時，所得MIPs對腺苷的結(jié)合效率更高。該研究為分子印跡制備提供了一個新方法，即在聚合中結(jié)合高親和性的生物聚合物片段，這些片段為一些低成本的化學(xué)合成的單體，而得到基于DNA化學(xué)的具高親和效率的印跡聚合物材料制備方法。

3.3 等溫滴定微量熱技術(shù)用于制備反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過ITC實(shí)驗(yàn)，根據(jù)熱譜曲線也可以優(yōu)化聚合時間。Gang等[32]為研究生物大分子表面印跡中最佳印跡效率的薄膜厚度與模板分子的結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，使用不同分子量的糖蛋白：核糖核酸酶B、葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶作為模板分子，將糖蛋白以共價鍵的形式固定到m-氨基苯硼酸修飾的SiO2或者Fe3O4粒子表面，并且用多巴胺使糖蛋白與印跡修飾表面交聯(lián)聚合。根據(jù)聚合時間的不同，制備不同厚度納米尺度的印跡薄膜。實(shí)驗(yàn)將每種糖蛋白印跡制備不同厚度的印跡膜，對其結(jié)合熱譜曲線進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論在簡單或是復(fù)雜的環(huán)境中，經(jīng)優(yōu)化后的糖蛋白分子印跡聚合物都可以識別模板分子。對具有最大結(jié)合量和印跡效果的印跡薄膜的研究結(jié)果顯示，印跡薄膜的厚度與模板分子的大小呈正相關(guān)，得出印跡薄膜的厚度應(yīng)據(jù)裝載的模板分子的幾何大小進(jìn)行調(diào)整，并揭示在印跡聚合物的設(shè)計中模板分子的結(jié)構(gòu)具有重大影響。Chen等[33]通過微量熱法測定了除草劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)與其分子印跡聚合物之間相互作用焓變化和熵變化，來探究該相互作用的性質(zhì)，確定模板分子與其分子印跡聚合物的親和性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為6時，熵主要驅(qū)動力，在水環(huán)境中模板與聚合物之間多依靠氫鍵和靜電作用相結(jié)合。

3.4 等溫滴定微量熱技術(shù)用于雙模板分子印跡聚合物研究 在一定程度上，ITC技術(shù)對探索分子印跡聚合物空間結(jié)構(gòu)方面也有幫助。John等[34]先以間氨基苯硼酸(APBA)為功能單體，過硫酸銨做引發(fā)劑，分別以溶菌酶和細(xì)胞色素C為模板分子，在玻璃片上制備了APBA印跡聚合薄膜。他們采用微量熱技術(shù)，印跡薄膜對模板蛋白的親和力由重吸附反應(yīng)得到的結(jié)果來評估，通過得到最大的ΔH來優(yōu)化印跡薄膜對模板蛋白的吸附量。研究發(fā)現(xiàn)，印跡薄膜對非模板蛋白的親和性遠(yuǎn)小于模板蛋白。于是他們又以溶菌酶和細(xì)胞色素C的復(fù)合物為模板合成印跡聚合薄膜[35]，觀察發(fā)現(xiàn)，重結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，混合溶液中溶菌酶和細(xì)胞色素C的2者摩爾比為43%:57%時，與功能單體結(jié)合得到的印跡聚合物能得到最大ΔH，達(dá)到最大吸附效率。而所得印跡聚合物對單一模板蛋白呈現(xiàn)很低的識別效果，聚合物僅對2種蛋白混合物具有識別，表明不同蛋白質(zhì)混合后進(jìn)行印跡時，蛋白間相互作用產(chǎn)生了新的印跡位點(diǎn)，在APBA聚合物上形成了一種不同于2種蛋白質(zhì)單獨(dú)印跡時的空間結(jié)構(gòu)。

4 展望

目前分子印跡技術(shù)的研究歷史相對較短，分子印跡技術(shù)的系統(tǒng)研究較少，有關(guān)分子印跡過程的熱力學(xué)和動力學(xué)等相關(guān)理論和報道還比較少。在MIPs識別、結(jié)合模板分子過程中，由于MIPs中存在與模板分子相匹配的空間結(jié)構(gòu)和識別位點(diǎn)，這其中會涉及到分子間和分子內(nèi)的諸多作用力，應(yīng)用微量熱法可以得到一系列熱力學(xué)參數(shù)，直觀反映出這些復(fù)雜體系中分子間相互作用力的大小，并為揭示其相互作用機(jī)理提供依據(jù)[36]，有助于進(jìn)一步研究分子印跡過程中分子內(nèi)和分子間，以及分子和聚合物之間作用的機(jī)制，從而制定合理的實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，得到具有高印跡效率的聚合物。ITC需樣量少，靈敏度高，反應(yīng)速度快，并具有實(shí)時、動態(tài)、在線等優(yōu)點(diǎn)，定量描述反應(yīng)過程。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信等溫滴定微量熱技術(shù)將會在分子印跡領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

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(編校：苗加會)

Application of isothermal titration calorimetry in molecular imprinting technique

HUANG Yan, ZHANG Ying-qingΔ

(School of Food and Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Molecular imprinting technique is a novel technology for preparing polymers with specific binding properties tosome specific molecules, and

widely attention in recent years.The article that was reviewed the applications of microcalorimetry in the molecular imprinting technique.The basic principle of microcalorimetry,characteristics and its advanced applications on evaluating imprinting effects of the molecularly imprinted polymers,screening of the monomers and the cross-linking agents, optimizing reaction conditions etc. were introduced.

molecular imprinting; isothermal titration calorimetry; screening; optimizing reaction conditions

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.043

黃妍，女，碩士在讀，研究方向：生物化工，E-mail:wuhanhuangyan@163.com；張迎慶，通信作者，女，博士，教授，研究方向：生物制藥，E-mail:yingqingzhang@163.com。

O642.2

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