高遷移率族蛋白1-HMGB-1：糖尿病視網(wǎng)膜病變中的新面孔

韓辰宇 張 敏?

高遷移率族蛋白1-HMGB-1：糖尿病視網(wǎng)膜病變中的新面孔

韓辰宇 張 敏?

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是世界范圍內(nèi)最主要的致盲眼病之一［1-2］。目前DR的發(fā)生機(jī)制尚未明確，因此缺少針對(duì)病因的有效治療，DR常導(dǎo)致患者進(jìn)行性的視功能損害甚至完全失明。多年來，眼科學(xué)家和內(nèi)分泌學(xué)家主要研究視網(wǎng)膜毛細(xì)血管微循環(huán)的改變，取得了豐碩的成果。然而，隨著研究的深入和技術(shù)手段的不斷更新，有研究者發(fā)現(xiàn)，在DR的發(fā)生發(fā)展中，除有視網(wǎng)膜微血管損害以外，還有進(jìn)行性的神經(jīng)組織的退行性變［3］。在此過程中，高遷移率族蛋白1（HMGB-1）作為炎性因子所觸發(fā)的網(wǎng)絡(luò)式級(jí)聯(lián)反應(yīng)不僅參與了視網(wǎng)膜的微血管病變，還通過促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化參與了炎性因子釋放、新生血管形成、血－視網(wǎng)膜屏障破壞和視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷，引起視網(wǎng)膜不可逆性的功能障礙。本文就HMGB-1在DR發(fā)病中的作用機(jī)制作一綜述。

1 HMGB-1

HMGB-1廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一種含量豐富的高度保守的非組核蛋白。其是一種含有兩極結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，包含兩個(gè)同源性的HMG boxes，A和B，分別含有75個(gè)氨基酸，HMGB-1的C-端是由酸性氨基酸組成的尾巴，N-端有肝素結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞內(nèi)具有穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)等多種功能。細(xì)胞壞死時(shí)，與DNA分離的HMGB-1從壞死的細(xì)胞中被動(dòng)釋放，此外，HMGB-1還可以經(jīng)活化的單核、巨噬細(xì)胞，成熟的樹突狀細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞主動(dòng)釋放。細(xì)胞外的HMGB-1作為炎性因子觸發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)。HMGB-1可以激活多種不同的受體，其中包括糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體2（toll-like receptor-2，TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等。在 HMGB-1的結(jié)構(gòu)中，B-box是真正參與炎性反應(yīng)的部分，其通過與RAGE結(jié)合，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1、2（extracellular signalregulated kinase 1 and 2，ERK1/2）以及核因子-B（nuclear factor Kappa B，NF-B），改變基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)具有致炎作用的細(xì)胞因子、趨化因子以及粘附蛋白的表達(dá)，強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，在DR的血管損傷及神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近年來，國內(nèi)外研究表明：慢性低度的炎癥反應(yīng)參與了DR的病理過程。而在此過程中，HMGB-1作為炎性介質(zhì)搭建了持續(xù)的炎性損傷與進(jìn)行性加重的視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性病變之間的橋梁。

2 RAGE介導(dǎo)的信號(hào)通路

RAGE是免疫球蛋白超家族成員，是一種跨膜受體，在一條多肽鏈上含有3個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域，可以介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過產(chǎn)生活性氧，激活MAPK及NF-B信號(hào)通路（細(xì)胞增殖與炎癥）、Ras通路（應(yīng)激和細(xì)胞凋亡）、Rac/Cdc42通路（細(xì)胞生長和運(yùn)動(dòng)）以及k/Stat通路（基因表達(dá)調(diào)控） 等，上調(diào)多種生長因子、細(xì)胞間粘附分子以及炎癥因子等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加血管通透性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張、血管基底膜增厚、微血管通透性增加、血小板聚集，進(jìn)而導(dǎo)致毛細(xì)血管栓塞，視網(wǎng)膜組織缺血缺氧［4］。對(duì)SD糖尿病鼠的研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞RAGE水平上調(diào)，而Muller細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞的主要成員，在糖尿病早期的特征性血管病變以及神經(jīng)元退行性病變中均起到重要作用，提示RAGE是DR的中心介導(dǎo)因素之一。在DR的進(jìn)程中，HMGB1主要作用于Muller細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（glial cell）以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（Retinal pigment epithelial，RPE）上的RAGE，介導(dǎo)視網(wǎng)膜周細(xì)胞的死亡和新生血管的形成、血管內(nèi)皮連接蛋白-閉合蛋白的數(shù)量減少和血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的退行性變以及神經(jīng)營養(yǎng)因子的過度消耗。

3 HMGB1介導(dǎo)的周細(xì)胞死亡和新生血管形成

在DR的發(fā)病機(jī)制中，現(xiàn)已形成4條經(jīng)典的通路，60年代Gabbay等［5］在Science上首先報(bào)道了導(dǎo)致DR發(fā)病的多元醇通路，70年代發(fā)現(xiàn)了非酶糖基化終末產(chǎn)物（AGE）機(jī)制［6］，80年代和90年代相繼揭示了蛋白激酶C（PKC）通路［7］以及氨基己糖通路［8］。這4條致病通路的激活將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的失衡，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜周細(xì)胞的死亡和新生血管的形成。然而，大量的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)表明，阻斷任何一條通路，均不能延緩DR的發(fā)生。因此DR發(fā)病機(jī)制上一定存在更多因素的相互協(xié)同以及上下游因子之間的網(wǎng)絡(luò)式級(jí)聯(lián)式反應(yīng)［9］。越來越多的基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)表明，炎癥參與了DR的發(fā)生，高血糖引起了細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的失衡，促使細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)分泌增多，使細(xì)胞和組織一直處于一種慢性低度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)，從而導(dǎo)致DR中周細(xì)胞的死亡和新生血管的形成，在此過程中，HMGB1起到了至關(guān)重要的作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞是視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的重要組成部分，而周細(xì)胞的死亡是糖尿病視網(wǎng)膜病變中的特征性損傷。在視網(wǎng)膜微血管的周細(xì)胞膜上，存在HMGB1受體RAGE的表達(dá)［10］，由此可推想，HMGB1作用于周細(xì)胞膜RAGE產(chǎn)生的毒性作用能夠?qū)е挛⒀苌现芗?xì)胞的死亡。然而，基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，用高濃度（10μg/ml）HMGB1作用過的周細(xì)胞與用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（對(duì)照組）作用過的周細(xì)胞比較，其生存率并無明顯差異。因?yàn)橐暰W(wǎng)膜微血管周細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間存在密切聯(lián)系，試驗(yàn)者進(jìn)一步探索神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否參與HMGB1介導(dǎo)的周細(xì)胞的死亡。試驗(yàn)表明，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)了HMGB1引發(fā)的周細(xì)胞死亡［11］。HMGB1作用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的RAGE，進(jìn)而激活p38 MAPK和ERK1/2。MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶［12］，能被多種物質(zhì)激活，介導(dǎo)由細(xì)胞表面至細(xì)胞核內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；ERK1/2也是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶中的一種，但其是脯氨酸特定導(dǎo)向的，只能使脯氨酸相鄰的絲氨酸-蘇氨酸磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。p38 MAPK和ERK1/2的激活，使NF-B磷酸化，上調(diào)炎癥因子ICAM-1、TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1的表達(dá)，導(dǎo)致白細(xì)胞釋放多種活性物質(zhì)入血，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管血流無灌注。視網(wǎng)膜血管的滲漏和無灌注是早期DR的主要病理表現(xiàn)，幾乎所有的視網(wǎng)膜損害均來源于此兩種病理改變，而HMGB1介導(dǎo)的新生血管形成，正是建立在這兩種改變之上。最新實(shí)驗(yàn)表明，HMGB1可直接作用于很多組織，使新生血管形成，但并不能直接作用于視網(wǎng)膜。2013年，Biscetti及其同事報(bào)道，無論是在視網(wǎng)膜下或是玻璃體液中注射HMGB1，所引起的新生血管形成與對(duì)照比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。然而，在缺血缺氧狀態(tài)下，HMGB1可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor，VEGF-A） 表達(dá)大幅增加，間接發(fā)揮作用。

4 HMGB1介導(dǎo)的Occludin的數(shù)量減少和BRB的損傷

血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）是視網(wǎng)膜組織生理的一個(gè)重要組成部分，BRB的通透性分為內(nèi)向通透性和外向通透性，前者是指物質(zhì)經(jīng)屏障進(jìn)入視網(wǎng)膜，后者是指視網(wǎng)膜內(nèi)物質(zhì)經(jīng)屏障到達(dá)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管腔或脈絡(luò)膜組織［13］。生理狀況下，內(nèi)向通透性明顯低于外向通透性，這是維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)所必需的。BRB由內(nèi)屏障和外屏障組成。外屏障屬上皮型屏障，由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成，包括頂部的縫隙鏈接、中部的閉鎖小帶和底部的粘連小帶，其中閉鎖小帶在外屏障中發(fā)揮最為重要的作用。內(nèi)屏障屬內(nèi)皮型屏障，由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成。內(nèi)皮細(xì)胞之間由上皮欄連接，分為粘連小帶和閉鎖小帶，前者為上皮欄的大部分；后者位于近管腔側(cè)，非常短，但是閉鎖小帶在內(nèi)屏障中起到關(guān)鍵作用。最近的研究顯示：BRB中的閉鎖小帶由獨(dú)特的蛋白質(zhì)裝配完全，其中，Occludin和Claudin這兩種跨膜蛋白的存在限制了大分子物質(zhì)在內(nèi)皮細(xì)胞之間的流動(dòng)。Occludin為一種6次跨膜蛋白，其N端和C端均位于視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)。其C端與胞漿中的ZO蛋白的N端相連，而ZO蛋白的C端又與胞漿中細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白相連。炎性因子作用于視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的RAGE，激活p38 MAPK和ERK1/2，使NF-B磷酸化，導(dǎo)致ICAM-1、TNF-a、IL-1b、IL-6、MCP-1等級(jí)聯(lián)式釋放，使骨架蛋白的穩(wěn)定性喪失，引起Occludin的移動(dòng)和重新分布，進(jìn)而使呈連續(xù)形態(tài)的細(xì)胞間連接變?yōu)殚g斷性，表現(xiàn)為BRB的損傷。研究證明，DR發(fā)生時(shí)，在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞連接處，Occludin蛋白數(shù)量減少，并重新分布，導(dǎo)致BRB屏障功能的缺失，在此過程中，HMGB1起到了不可替代的作用。

為了證明HMGB1可以介導(dǎo)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接處閉合蛋白數(shù)量的減少，研究者使用定量免疫印跡法測量了糖尿病大鼠、晶狀體內(nèi)注射HMGB1的糖尿病大鼠、晶狀體內(nèi)注射PBS的糖尿病大鼠以及正常大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管中閉合蛋白的數(shù)量，結(jié)果表明：單純糖尿病大鼠中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞閉合蛋白的數(shù)量較正常大鼠下降30%，而晶狀體內(nèi)注射HMGB1的糖尿病大鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞閉合蛋白的數(shù)量較晶狀體內(nèi)注射PBS的糖尿病大鼠下降55%。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體內(nèi)注射HMGB1的正常大鼠，RAGE、NF-B以及炎癥因子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)均增加，而TLR2和閉合蛋白的表達(dá)均下降。由此可以推斷，HMGB1依然是通過RAGE來介導(dǎo)閉合蛋白的數(shù)量減少，而非TLR2。

5 HMGB1介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞退行性變

近年來，與DR相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果顯示，在未出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管病理改變之前，即可見神經(jīng)視網(wǎng)膜的損傷，繼而出現(xiàn)視網(wǎng)膜的功能改變，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜電圖中振蕩電位峰值的降低、潛伏時(shí)的延遲、a波的波幅降低、暗適應(yīng)能力減弱、對(duì)比敏感度下降、藍(lán)黃色覺異常及視野損害等變化［14］。DR早期即可出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、無長突細(xì)胞及視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特征性病理改變，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜無長突細(xì)胞的數(shù)量減少以及Muller細(xì)胞的功能紊亂［15］。Muller細(xì)胞的胞體位于內(nèi)核層，但其突起卻占據(jù)從內(nèi)界膜至外界膜的整個(gè)視網(wǎng)膜厚度，甚至越過外界膜形成絨毛纖維，即所謂的纖維欄。Muller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜的支持細(xì)胞，其突起包纏著大部分神經(jīng)細(xì)胞，為神經(jīng)細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)。電鏡下，與其周圍細(xì)胞比較，Muller細(xì)胞的胞質(zhì)中包含許多發(fā)育良好的纖維，纖維的走形方向不定，但貼近細(xì)胞膜表面，大致方向與細(xì)胞膜平行，使Muller細(xì)胞的突起形成許多環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將神經(jīng)細(xì)胞的突起包繞，視網(wǎng)膜中的毛細(xì)血管大部分也被Muller細(xì)胞的突起所包繞。因此，在視網(wǎng)膜特異性的“神經(jīng)—血管耦連”中，Muller細(xì)胞起到了不可或缺的作用，在維持視網(wǎng)膜的生理功能上扮演著“代謝共生”的角色。病理狀態(tài)下，HMGB1等炎癥因子的激活可引起Muller細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化增生，即Muller細(xì)胞的活化。而Muller細(xì)胞的活化對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及其他的視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、光感受器細(xì)胞等細(xì)胞的功能既存在修復(fù)作用，又存在損傷的可能。

HMGB1作為炎性因子如何介導(dǎo)DR神經(jīng)退行性變目前尚無定論，近幾年的基礎(chǔ)研究證明：晶狀體內(nèi)注射HMGB1，可使視網(wǎng)膜中活化的caspase-3和谷氨酸（glutamate）表達(dá)上調(diào)，而酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、谷氨酰胺合成酶（glutamine syn- thetase，GS）、和乙二醛酶1（glyoxalase 1，GLO 1）的表達(dá)和活性下降。這為HMGB1引起的神經(jīng)損傷機(jī)制提供了新的思路：（1）HMGB1可以激活caspase-3，導(dǎo)致無長突細(xì)胞死亡。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷機(jī)制的重要組成部分。DR早期，HMGB1可誘導(dǎo)caspase-3的激活，使無長突細(xì)胞數(shù)量減少，而TH作為無長突細(xì)胞的特有標(biāo)志物，在晶狀體內(nèi)注射HMGB1的小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)下降，證實(shí)了無長突細(xì)胞減少的結(jié)果。（2）HMGB1可使視網(wǎng)膜內(nèi)谷氨酸含量增加。谷氨酸是大腦和視網(wǎng)膜的主要興奮性氨基酸，然而，多項(xiàng)研究表明，DR中谷氨酸穩(wěn)態(tài)失調(diào)，視網(wǎng)膜細(xì)胞外的谷氨酸毒性水平增加，細(xì)胞外的谷氨酸誘導(dǎo)激活N-甲基-D天門冬氨酸（NMDA）受體，致大量鈣離子和鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。HMGB1可作用于視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞，使GS的活性下降，而在視網(wǎng)膜中，Muller細(xì)胞是唯一具有GS的細(xì)胞，并能表達(dá)具備高親和力的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，通過GS將谷氨基酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，降低谷氨酸濃度，解除對(duì)神經(jīng)元的毒性作用。此外，HMGB1還可以促進(jìn)谷氨酸從神經(jīng)膠粒（gliosomes）中釋放，而從神經(jīng)膠粒中釋放的谷氨酸又可以進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的表達(dá)，這種正反饋機(jī)制加重了谷氨酸所引起的細(xì)胞毒作用。（3）HMGB1可使GLO1活性減低，增加體內(nèi)糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的數(shù)量。AGEs為葡萄糖通過非酶糖基化作用與大分子物質(zhì)形成的不可逆性交聯(lián)共價(jià)產(chǎn)物，在持續(xù)高血糖環(huán)境中，葡萄糖通過非酶化反應(yīng)與蛋白質(zhì)中氨基酸等相互作用形成Schiff失衡堿，后者進(jìn)一步發(fā)生分子結(jié)構(gòu)重排，產(chǎn)生較穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物，并最終形成復(fù)雜的AGEs。DR中，AGEs可致視網(wǎng)膜周細(xì)胞損傷。丙酮醛（MG）是AGEs的前體物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)化為AGEs。此外，MG還可以調(diào)節(jié)共阻遏子mSm3A的活性，從而增加血管緊張素2的表達(dá)，使血管緊張素2系統(tǒng)的活性增高。促進(jìn)周細(xì)胞從血管內(nèi)皮的分離和遷徙，最終導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜周細(xì)胞的丟失。GLO1可消除體內(nèi)MG，抑制細(xì)胞內(nèi)AGEs的生成，起到解毒作用。HMGB1可使體內(nèi)GLO1的活性下降，導(dǎo)致體內(nèi)MG和AGEs數(shù)量增加，加速DR的進(jìn)展。（4）HMGB1使體內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子過度消耗。視網(wǎng)膜包含大量的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、色素上皮衍生因子（PEDF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能維持方面起著重要的作用。BDNF由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）、Muller細(xì)胞產(chǎn)生，作用于酪氨酸激酶受體（Tr-B），其效應(yīng)主要依賴BDNF與受體結(jié)合的親和力及受體激活后下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。在缺氧條件下BDNF通過增加Muller細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取及上調(diào)GS的表達(dá)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)血清BDNF含量與HMGB1呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此可知，HMGB1可能介導(dǎo)了BDNF的耗竭，導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的退行性變，加速了DR的進(jìn)展。

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201700 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院內(nèi)分泌科

*通信作者