急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘腦組織TRH表達(dá)變化

屈丹，姜雅秋( 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，沈陽000;2本溪市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科)

急性低血糖大鼠血清FT3、FT4、TSH水平及下丘腦組織TRH表達(dá)變化

屈丹1，2，姜雅秋1
( 1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科，內(nèi)分泌研究所，沈陽110001;2本溪市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科)

摘要:目的觀察急性低血糖大鼠血清游離三碘甲狀腺原氨酸( FT3)、游離甲狀腺素( FT4)、促甲狀腺激素( TSH)水平及下丘腦組織促甲狀腺激素釋放激素( TRH)表達(dá)的變化。方法Wistar大鼠21只，根據(jù)血糖水平分為正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組3組，每組7只，后兩組腹腔注射短效胰島素誘導(dǎo)急性低血糖，輕度低血糖組血糖2.0～2.64 mmol/L，重度低血糖組血糖＜2.0 mmol/L。化學(xué)發(fā)光免疫法檢測各組大鼠血清FT3、FT4、TSH，Western blotting法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分別檢測各組大鼠下丘腦組織中的TRH蛋白及mRNA。結(jié)果正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組FT3分別為( 5.05±1.40)、( 4.82±1.22)、( 4.92±1.08) pmol/L，F(xiàn)T4分別為( 2.45±0.26)、( 2.19±0.11)、( 2.30±0.21) pmol/L，TSH分別為( 0.16±0.10)、( 0.05±0.03)、( 0.04±0.04)μIU/mL，輕度低血糖組、重度低血糖組分別與正常血糖組FT4、TSH比較，P均＜0.05。正常血糖組、輕度低血糖組、重度低血糖組TRH蛋白分別為0.66±0.01、0.34±0.01、0.52± 0.07，TRH mRNA分別為1.44±0.10、0.54±0.04、2.42±0.97，輕度低血糖組、重度低血糖組分別與正常血糖組比較，輕度低血糖組與重度低血糖組比較，P均＜0.05。結(jié)論急性低血糖大鼠血清FT4、TSH水平降低，F(xiàn)T3不變，下丘腦組織中TRH蛋白表達(dá)降低，TRH mRNA表達(dá)先降低后升高。

關(guān)鍵詞:應(yīng)激反應(yīng);低血糖;游離三碘甲狀腺原氨酸;游離甲狀腺素;促甲狀腺激素;促甲狀腺激素釋放激素

應(yīng)激是一種機(jī)體多系統(tǒng)共同參與的全身性適應(yīng)反應(yīng)，在應(yīng)激原的刺激下，機(jī)體過度分泌或抑制相關(guān)應(yīng)激激素。在創(chuàng)傷應(yīng)激相關(guān)激素中最有特異性的指標(biāo)為皮質(zhì)醇和甲狀腺激素，兩者具有對(duì)應(yīng)激后機(jī)體的保護(hù)作用。急性低血糖作為一種急性應(yīng)激狀態(tài)，在低血糖發(fā)生時(shí)，下丘腦的“糖感受器”將信息迅速傳遞到相關(guān)神經(jīng)元，引起下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素( CRH)細(xì)胞興奮，同時(shí)表達(dá)促甲狀腺激素釋放激素( TRH)。本研究觀察了急性低血糖大鼠血清游離三碘甲狀腺原氨酸( FT3)、游離甲狀腺素( FT4)、促甲狀腺激素( TSH)水平及下丘腦組織TRH表達(dá)的變化。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與試劑3～8周齡SPF級(jí)Wistar雄性大鼠21只，體質(zhì)量200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FT3、FT4、TSH采用西門子DPC Immulite 2000型自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀檢測，TRIzol購自大連寶生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司，TRH及β-actin引物購自大連寶生物公司，TRH一抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理根據(jù)血糖水平分為正常血糖［1］組、輕度低血糖組、重度低血糖組3組，每組7只。后兩組采用胰島素腹腔注射誘導(dǎo)大鼠低血糖的方法［2］，腹腔注射短效胰島素(生物合成人胰島素，諾和諾德公司，50 U/kg)。以微型血糖儀(德國羅康全)斷尾法測量血糖，并記錄所有大鼠腹腔注射胰島素后每隔30 min的血糖值，直至達(dá)到目標(biāo)血糖。輕度低血糖組血糖2.0～2.64 mmol/L，大鼠興奮、身體發(fā)抖、四處覓食;重度低血糖組血糖＜2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚甚至全身抽搐。大鼠稱體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔麻醉后，上腹正中切口，游離肋骨，心臟采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，存入Eppendorf管中，－80℃冰箱中保存。大鼠經(jīng)心臟采血后，斷頭，3 min內(nèi)取腦，分離腦組織后迅速置于－40℃干冰異戊烷中30 s，快速冷凍腦組織，后于－80℃冰箱凍存。

1.3各組大鼠血清FT3、FT4、TSH檢測采用化學(xué)發(fā)光免疫法，按照西門子DPC Immulite 2000型自動(dòng)發(fā)光免疫分析儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。

1.4各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白檢測采用Western blotting法。組織裂解液裂解下丘腦組織，

12 000 r/min離心5 min，取上清，測定總蛋白含量。已溶解于加樣緩沖液的總蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，100 V電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，脫脂奶粉封閉液封閉2 h，用1∶100稀釋TRH抗體(兔抗鼠多克隆抗體，北京博奧森公司)進(jìn)行Western蛋白印跡雜交，40℃孵育過夜。1∶400稀釋的二抗孵育2 h，采用DAB顯色試劑盒顯影并檢測。以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。

1.5各組大鼠下丘腦組織TRH mRNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照Paxinos-Watson的大鼠腦立體定位圖譜，取下丘腦組織50～100 mg，用TRIzol法提取總RNA，取1 μg總RNA用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，再用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。GLP-1R上游引物: 5'-CGACCCTGGATTCGGGAGTA-3'，下游引物: 5'-AGGCGCAGGATTCAGGGATA-3'，產(chǎn)物長度145 bp; GAPDH的上游引物: 5'-TGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3'，下游引物: 5'-CCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG-3'，產(chǎn)物長度123 bp，反應(yīng)體系25 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件: 37℃15 min，85℃5 s; PCR反應(yīng)條件: 95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次; PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析DNA擴(kuò)增曲線，使用專用數(shù)據(jù)處理軟件獲取數(shù)據(jù)，以2－ΔΔCt代表目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用Cruskal Wallis分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較見表1。各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達(dá)比較見表2。

表1　各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較(±s)

表1　各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較(±s)

注:與正常血糖組比較，ΔP＜0.05。

組別　FT3( pmol/L)　 FT4( pmol/L)　 TSH(μIU/mL)正常血糖組5.05±1.40　 2.45±0.26　 0.16±0.10輕度低血糖組　4.82±1.22　 2.19±0.11Δ　0.05±0.03Δ重度低血糖組　4.92±1.08　 2.30±0.21Δ　0.04±0.04Δ

表2　各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達(dá)比較(±s)

表2　各組大鼠下丘腦組織TRH蛋白、mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與正常血糖組比較，ΔP＜0.05;與輕度低血糖組比較，▲P＜0.05。

組別　TRH蛋白TRH mRNA正常血糖組0.66±0.01　1.44±0.10輕度低血糖組　0.34±0.01Δ　0.54±0.04Δ重度低血糖組　0.52±0.07Δ▲　2.42±0.97Δ▲

3　討論

下丘腦-垂體-甲狀腺軸的活性在能量平衡中至關(guān)重要，對(duì)身體和心理應(yīng)激起著不同的調(diào)節(jié)作用。既往關(guān)于應(yīng)激時(shí)甲狀腺軸改變報(bào)道不一，曾有報(bào)道顯示運(yùn)動(dòng)、焦慮、明暗交替等應(yīng)激時(shí)甲狀腺軸會(huì)被抑制［3］，可能是通過降低代謝而保存能量。饑餓時(shí)人類T3、T4、TSH降低，低甲狀腺素水平無法激發(fā)TRH產(chǎn)生增多。在饑餓的嚙齒類動(dòng)物中，除了甲狀腺激素水平降低外，還觀察到釋放到垂體門脈系統(tǒng)的TRH減少，TRH mRNA水平降低。外科手術(shù)或重癥創(chuàng)傷等應(yīng)激刺激可引起生長抑素的分泌，使TSH釋放減少，T3、T4分泌減少，以減少機(jī)體的代謝消耗。大鼠慢性不可預(yù)見應(yīng)激可引起T3、T4下降，并能干擾下丘腦-垂體-甲狀腺軸的日節(jié)律［4］。Uribe等［5］發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠下丘腦室旁核TRH mRNA和TSH下降后，垂體前葉TRHR1 mRNA水平升高，血甲狀腺激素水平不變。TRH神經(jīng)元接受中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部位的調(diào)控，這些部位的神經(jīng)元將環(huán)境刺激與TRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)起來，并借TRH神經(jīng)元與腺垂體建立神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)聯(lián)系。例如寒冷刺激的信息傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，一方面再傳遞到下丘腦的體溫調(diào)節(jié)中樞，另一方面又立即傳遞到附近的TRH神經(jīng)元，使TRH分泌增多，進(jìn)而增加TSH的分泌，血T3、T4隨之升高。

危重疾病時(shí)由于組織損害及內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重失調(diào)，應(yīng)激可以使甲狀腺激素代謝途徑改變，血清T3、T4水平發(fā)生變化，這種臨床現(xiàn)象被稱為非甲狀腺疾病綜合征，又稱低T3綜合征或甲狀腺功能正常病態(tài)綜合征，幾乎在所有的急性或慢性非甲狀腺疾病患者都會(huì)發(fā)生［6～8］。循環(huán)中T3的分泌有20%來自于甲狀腺，由肝細(xì)胞的Ⅰ型碘化甲狀腺原氨酸5'-脫碘酶對(duì)T4的轉(zhuǎn)化而來。非甲狀腺疾病綜合征時(shí)肝臟中該酶作用障礙，使得血清T3水平降低，血清反T3水平升高。低水平的T3反過來會(huì)進(jìn)一步減少5'-脫碘酶的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致血漿T3濃度呈螺旋式下降［8］。與此同時(shí)，TSH的水平通常保持在正常范圍內(nèi)，或僅有輕度增加。約50%非甲狀腺疾病綜合征患者也會(huì)出現(xiàn)TSH水平下降，提示這種伴隨情況可能來自下丘腦/垂體的調(diào)控［9］。引起這些變化的機(jī)制仍存在爭議，可能是應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體降低新陳代謝率的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，或是某種潛在生理調(diào)控過程的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)，急性低血糖時(shí)大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸表現(xiàn)為血清FT4、TSH降低，F(xiàn)T3不變，下丘腦組織中TRH蛋白表達(dá)降低，TRH mRNA表達(dá)先降低后升高?？梢娂毙缘脱亲鳛橐环N急性應(yīng)激狀態(tài)，下丘腦-垂體-甲狀腺軸此時(shí)處于被抑制狀態(tài)。既往曾有日本學(xué)者報(bào)道給予胰島素時(shí)會(huì)引起下丘腦TRH先降低后升高，從而刺激TSH分泌增多，T3增多。這是

胰島素對(duì)下丘腦的作用，還是急性低血糖對(duì)下丘腦的作用，還有待于進(jìn)一步探討。中樞對(duì)低血糖的調(diào)控有重要作用，嚴(yán)重低血糖的發(fā)生主要原因在于中樞對(duì)低血糖的拮抗調(diào)節(jié)系統(tǒng)沒有被激活，因此尋找這種中樞不能有效啟動(dòng)拮抗調(diào)節(jié)的機(jī)制就十分重要。而感知低血糖的特殊神經(jīng)元分布在門靜脈和腦。血糖感受神經(jīng)元能感受到其所處環(huán)境中血糖的變化，并且相應(yīng)地改變其代謝率。在大腦皮質(zhì)下區(qū)分布著更高級(jí)的血糖感受調(diào)控系統(tǒng)，其對(duì)低血糖發(fā)出應(yīng)激信號(hào)，產(chǎn)生對(duì)低血糖的神經(jīng)內(nèi)分泌負(fù)調(diào)節(jié)反應(yīng)( CRR)。對(duì)低血糖的CRR包括興奮交感神經(jīng)，刺激高血糖素的分泌及影響下丘腦垂體腎上腺軸。這些產(chǎn)生應(yīng)激信號(hào)的皮質(zhì)下區(qū)通過神經(jīng)纖維和下丘腦等部位聯(lián)系，應(yīng)激時(shí)通過各系統(tǒng)共同作用維持機(jī)體能量平衡。在下丘腦中，神經(jīng)元的肽類激素組成各種不同功能的調(diào)節(jié)環(huán)路。CRH和TRH組成的環(huán)路主要是調(diào)節(jié)熱能生產(chǎn)和應(yīng)激反應(yīng)。TRH還是瘦素/神經(jīng)肽的食欲和體質(zhì)量調(diào)節(jié)環(huán)路中的成員，參與食欲、攝食、飽感、體質(zhì)量和熱能生成的中樞調(diào)節(jié)。因此，TRH在中樞對(duì)低血糖的調(diào)控方面可能發(fā)揮一定的作用。

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收稿日期:( 2015-04-27)

通信作者:姜雅秋

基金項(xiàng)目:遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃重大、重點(diǎn)項(xiàng)目( 2012225021)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)31-0030-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R363.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.011