脊髓繼發(fā)性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛表達(dá)、SOD活性及MDA含量變化

脊髓繼發(fā)性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛表達(dá)、SOD活性及MDA含量變化

張?jiān)露?，許燦1，藺靜1，黃一茜1，張靜2

(1保定市第一中心醫(yī)院，河北保定071000；2河北醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院)

摘要：目的觀察脊髓繼發(fā)性損傷大鼠脊髓組織中丙烯醛(ACR)表達(dá)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量變化。方法健康雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組30只、假手術(shù)組18只。實(shí)驗(yàn)組采用改良Allen′s-WD法制備大鼠脊髓繼發(fā)性損傷模型，假手術(shù)組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取脊髓組織，HE染色觀察脊髓組織病理變化，采用免疫組化法檢測(cè)脊髓組織中的ACR，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達(dá)量、MDA含量高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于假手術(shù)組(P均<0.01)。結(jié)論 大鼠脊髓繼發(fā)性損傷組織中ACR表達(dá)及MDA含量升高，SOD活性降低。

關(guān)鍵詞：脊髓損傷；脊髓繼發(fā)性損傷；丙烯醛；超氧化物歧化酶；丙二醛

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R651.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-06-27)

通信作者：張靜

氧化應(yīng)激反應(yīng)在脊髓繼發(fā)性損傷的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1]。研究[2]表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量自由基如丙二醛(MDA)，耗竭內(nèi)源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)，破壞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致脊髓組織損傷進(jìn)一步加重。臨床清除自由基療法尚未取得滿意效果,有學(xué)者推測(cè)脊髓繼發(fā)性損傷后可能有毒性更強(qiáng)、半衰期更長(zhǎng)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物如丙烯醛(ACR)等產(chǎn)生，使損傷持續(xù)進(jìn)展。2010年5月~2011年1月，我們觀察了大鼠脊髓繼發(fā)性損傷組織中ACR表達(dá)、SOD活性及MDA含量變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料SPF級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量240~280 g。兔抗丙烯醛多克隆抗體，PV9003、DAB顯色試劑盒，EZ ECL試劑盒，SOD試劑盒及MDA試劑盒，分光光度計(jì)，石蠟切片機(jī)，低溫冰箱，半干電轉(zhuǎn)移槽及垂直電泳槽等。

1.2大鼠脊髓繼發(fā)性損傷模型建立將48只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組30只、假手術(shù)組18只。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)改良Allen′s-WD法制作脊髓繼發(fā)性損傷模型：0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，暴露T11段脊髓，將打擊裝置整合于立體定位儀上，將一直徑3 mm圓形薄金屬墊片(3 mm×4 mm，質(zhì)量0.1 g)置于T11段脊髓表面，以10 g砝碼從6.5 cm高度自由墜落打擊墊片，造成以T11段為中心的脊髓急性損傷。假手術(shù)組暴露脊髓后立即縫合。分別于建模后24 h、3 d、7 d處死大鼠，取原手術(shù)切口暴露T10~12段，在冰袋上解剖椎管，取出包括損傷段及損傷階段上下段脊髓組織(繼發(fā)性損傷組織)2 cm置于-80 ℃冰箱中保存，留作SOD、MDA檢測(cè)。取大鼠脊髓組織，浸入4%中性甲醛溶液12~24 h后，留取損傷區(qū)及其上下各0.5 cm范圍的脊髓組織，以備組織病理學(xué)檢查及ACR檢測(cè)。

1.3脊髓組織病理觀察將脊髓組織常規(guī)切片脫蠟至水，HE染色后于普通顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化情況。

1.4脊髓組織中ACR、SOD、MDA檢測(cè)分別于建模后24 h、3 d、7 d采用免疫組化法檢測(cè)脊髓組織中的ACR，以陽(yáng)性細(xì)胞染色的平均光密度值代表表達(dá)量。采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1脊髓組織病理變化假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量正常。實(shí)驗(yàn)組建模后24 h可見(jiàn)局灶性出血，神經(jīng)元腫脹、變圓、數(shù)目減少，神經(jīng)元核固縮、碎裂，尼氏小體淡染或消失；建模后7 d神經(jīng)元數(shù)目減少，內(nèi)有空泡形成。

2.2兩組脊髓組織中ACR表達(dá)、SOD活性、MDA含量比較實(shí)驗(yàn)組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達(dá)、MDA含量高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織SOD活性低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　 建模后不同時(shí)點(diǎn)兩組脊髓組織中ACR表達(dá)、

SOD活性、MDA含量比較( ± s)

表1　 建模后不同時(shí)點(diǎn)兩組脊髓組織中ACR表達(dá)、

組別nACRSOD活性(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)實(shí)驗(yàn)組30 建模后24h0.3636±0.0100124.7±8.812.30±1.20 建模后3d0.3462±0.0157137.7±4.811.90±1.14 建模后7d0.3052±0.0162145.9±5.711.01±1.09假手術(shù)組18 建模后24h0.1613±0.3910*241.3±12.3#6.34±0.50# 建模后3d0.1762±0.2143*262.6±15.6#6.35±0.64# 建模后7d0.2036±0.2452*255.7±16.4#7.01±0.45#

注：與同時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組相比，*P<0.05；與同時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組相比，#P<0.01。

3討論

脊髓繼發(fā)性損傷發(fā)生在原發(fā)性損傷后數(shù)小時(shí)、數(shù)天及數(shù)周，可導(dǎo)致原發(fā)傷周?chē)＜顾杞M織損傷[1]，繼發(fā)性損傷機(jī)制包括缺血再灌注損傷、炎癥、氧化應(yīng)激及谷氨酸等興奮性氨基酸毒性等[3]。自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是引起脊髓繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一[4]。然而目前現(xiàn)有的清除自由基療法臨床療效并不滿意。

研究[5]表明，丙烯醛的損傷作用機(jī)制包括兩個(gè)方面：其一是作為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的誘發(fā)者，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)入惡性循環(huán)，造成細(xì)胞永久損傷；其二是通過(guò)與蛋白耦聯(lián)引起細(xì)胞凋亡。有學(xué)者[6]建立了體外PC12細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)ACR可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且ACR的細(xì)胞毒性較MDA、HNE及其他脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物更強(qiáng)。Due等[7]發(fā)現(xiàn)，在大鼠脊髓損傷模型中，ACR表達(dá)顯著增加，推測(cè)其在大鼠運(yùn)動(dòng)癱瘓及神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生中可能起重要作用。在豚鼠離體壓縮性脊髓損傷模型中，ACR表達(dá)在脊髓損傷后4 h開(kāi)始增高，24 h后達(dá)到峰值并能持續(xù)1周甚至更長(zhǎng)時(shí)間，使ACR對(duì)脊髓的損傷作用持續(xù)存在，而使用其特效清除劑后，神經(jīng)元細(xì)胞膜損傷明顯減輕[8]。

MDA也是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物[9]，可反映細(xì)胞受損后氧自由基含量變化及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度。SOD是超氧自由基的特異性清除酶，能明顯減輕自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，其活性高低可反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[10]。在繼發(fā)性損傷早期，SOD活力值最高，機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用；然而，隨著ACR表達(dá)持續(xù)存在，MDA含量逐漸增加，SOD不斷耗竭，SOD活性也逐漸降低。研究[11]表明，ACR在神經(jīng)退行性疾病患者腦組織中水平升高，增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平，引起MDA含量升高，SOD活性下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組建模后24 h、3 d、7 d脊髓組織中ACR表達(dá)量、MDA含量高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組，SOD活性低于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)假手術(shù)組。上述結(jié)果提示，脊髓損傷后機(jī)體內(nèi)部即產(chǎn)生ACR、MDA，隨著ACR、MDA持續(xù)生成，SOD活性降低，脊髓損傷持續(xù)存在。結(jié)合病理觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組隨建模時(shí)間延長(zhǎng)，脊髓組織病理變化逐漸加重，進(jìn)一步表明大鼠脊髓損傷后，體內(nèi)ACR及自由基大量釋放，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成嚴(yán)重破壞。今后我們將研究ACR表達(dá)與自由基生成的相關(guān)性，尋找相關(guān)清除劑以期減輕ACR對(duì)脊髓組織的損傷程度。

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