增強型體外反搏對心臟驟停犬血清一氧化氮系統(tǒng)的影響

劉榮 梁子敬 廖曉星 李欣 胡春林 戴剛 張作鵬 晏平

心臟驟停(cardiac arrest，CA)者經(jīng)心肺復(fù)蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)恢復(fù)自主循環(huán)后，由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)生成的一氧化氮(nitric oxide，NO)參與腦缺血/再灌注損傷的發(fā)展。NO是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，適量的NO具有調(diào)節(jié)腦血管張力、抑制血小板聚集等保護作用，而過量的NO則有神經(jīng)毒性作用[1]。其作用的差異依賴于NO的起源，內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)產(chǎn)生的NO有神經(jīng)保護作用。神經(jīng)元型NOS(neuronal NOS，nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)過度表達(dá)所產(chǎn)生的NO有神經(jīng)毒性作用。NO在腦損傷的病理生理過程中起著重要的作用，如彌漫性腦損傷大鼠腦組織中NO含量和nNOS、iNOS、eNOS的mRNA存在明顯時程變化[2]。NO作為神經(jīng)遞質(zhì)，與CPR后腦缺血/再灌注損傷相關(guān)病理生理的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后均密切相關(guān)。無創(chuàng)輔助循環(huán)裝置增強型體外反搏(enhanced external counterpulsation，EECP)是在心臟舒張期序貫地加壓于下肢和臀部，驅(qū)動血液向心臟返流，產(chǎn)生舒張期增壓波。反搏過程中改變了脈動血流方式[3]，增加心臟、腦等組織器官的血液灌流。EECP還可以改善冠心病患者的血管內(nèi)皮功能[4-5]，對急性心肌梗死犬模型可促進(jìn)NO的產(chǎn)生，改善其血流動力學(xué)[6]。目前尚無EECP對復(fù)蘇后機體血清nNOS、iNOS和eNOS影響的相關(guān)報道。本實驗中建立CA犬模型自主循環(huán)恢復(fù)(return of spontaneous circulation, ROSC) 后應(yīng)用EECP進(jìn)行干預(yù)，觀察EECP對NO、nNOS、iNOS和eNOS的影響，探討EECP對ROSC后NO系統(tǒng)的具體影響進(jìn)行。

資料與方法

一、一般資料

選擇雄性雜種犬16只，體重10～15 kg，犬齡18～30個月。犬的麻醉、監(jiān)護、致顫、心肺復(fù)蘇操作見文獻(xiàn)報道的方法[7-8]。以心外膜致顫的方式誘發(fā)CA。室顫持續(xù)無干預(yù)6 min后CPR，ROSC后予重癥監(jiān)護。根據(jù)隨機數(shù)字表法將16只犬分為2組:分別為對照組(8只)和EECP組(8只)。

本實驗經(jīng)實驗動物倫理委員會中山大學(xué)批準(zhǔn)。實驗在中山大學(xué)衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室進(jìn)行。

二、EECP干預(yù)

EECP方法參照文獻(xiàn)報道的方法[8-9]。動物取右側(cè)臥位，以0.035～ 0.04 MPa壓力反搏。實驗犬在ROSC后15 min行EECP各3 h，EECP后繼續(xù)監(jiān)護1 h。對照組則不予EECP，其他措施與EECP組相同。觀察終點為ROSC后96 h。所有動物分別于CA前基礎(chǔ)狀態(tài)下及ROSC后15 min、4 h、96 h采血并分離血清于-80℃冰箱凍存。

三、血清NO、eNOS、nNOS、iNOS測定

凍存血清解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國,CUSABIO)測定犬血清NO、eNOS、nNOS、iNOS，測定嚴(yán)格按照說明書操作。使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(奧地利,Sunrise，Tecan)在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(A)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、EECP組與對照組一般情況比較結(jié)果

所有動物均建模成功，EECP干預(yù)前，兩組犬間體重、肛溫、呼吸頻率、心率以及CPR至ROSC時間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。EECP組所有犬均順利完成干預(yù)。

二、EECP組與對照組血清NO、eNOS、nNOS和iNOS比較結(jié)果

基礎(chǔ)狀態(tài)下和ROSC后15 min，兩組間血清NO、eNOS、nNOS和iNOS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。

EECP可升高血清NO水平：ROSC后4 h、96 h，EECP組血清NO含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)(表2)。

表1 EECP組與對照組一般情況比較

注：W為體重，T為肛溫，R為呼吸頻率，HR為心率，ROSC為心肺復(fù)蘇至自主循環(huán)恢復(fù)的時間。EECP組與對照組間分別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，均P> 0.05。

表2 不同時間點下兩組血清NO、eNOS、nNOS和iNOS的結(jié)果比較

注：NO為一氧化氮、eNOS為內(nèi)皮型一氧化氮合酶、nNOS 為神經(jīng)元型一氧化氮合酶、iNOS為誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；ROSC為自主循環(huán)恢復(fù)；a表示與對照組比較P< 0.05，b表示與對照組比較P< 0.01。

EECP可升高血清eNOS水平：ROSC后4 h、96 h，EECP組血清eNOS含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

CA-ROSC后的一段時間內(nèi)，血清iNOS水平較基礎(chǔ)狀態(tài)時升高近十倍[(15.90±7.04)U/mL vs (130.34±86.72)U/mL ，(129.88±45.49)U/mL，(110.38±53.69)U/mL]，EECP干預(yù)可降低病理狀態(tài)下的血清iNOS水平：ROSC后4 h、96 h，EECP組血清eNOS含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

CA-ROSC后機體在缺血/再灌注損傷下細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生重大變化，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)及血清發(fā)生一系列病理生理改變，血清NO-NOS系統(tǒng)的改變是眾多環(huán)節(jié)之一。作為無創(chuàng)輔助裝置EECP，其治療可明顯增加冠狀動脈、腦及各內(nèi)臟器官的血流灌注。此前已有研究證實EECP可增加缺血性腦梗塞患者的腦血流并改善其腦神經(jīng)功能[10-11]。本項目前期研究結(jié)果已顯示，EECP治療(每天1 h，連續(xù)3 d)可增加復(fù)蘇后比格犬血清NO水平、降低內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平，調(diào)整血管舒縮功能，增加CPR后犬模型的腦血流灌注，改善其神經(jīng)功能[8,12-15]。本研究再次證實EECP治療(復(fù)蘇后即行連續(xù)EECP 3 h)可升高CA-ROSC模型犬血清NO水平，且EECP對復(fù)蘇后的初期(15 min)干預(yù)，不僅在ROSC后4 h發(fā)現(xiàn)有明顯上調(diào)NO的作用，且該作用可持續(xù)長達(dá)96 h。這應(yīng)是EECP對CA后機體整體的良性作用結(jié)果，尤其是對增加各重要器官血流、改善微循環(huán)所起的積極作用。

此前亦有研究表明[16-17]，吸入NO可通過可溶性鳥苷酸環(huán)化酶途徑作用，改善復(fù)蘇后大鼠模型的預(yù)后。不同來源的NO(nNOS、iNOS和eNOS)具有各自特有的生理功能，在復(fù)蘇后的病理生理過程中起到不同的作用。根據(jù)本研究兩間血清nNOS、iNOS和eNOS的差異可看出，EECP對CA-ROSC模型犬血清NO的上調(diào)作用，可能是通過上調(diào)eNOS并下調(diào)iNOS共同造成的結(jié)果。

血流對血管內(nèi)皮的切應(yīng)力被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的重要刺激因素，切應(yīng)力水平與NO的釋放呈正相關(guān)[18-21]，EECP干預(yù)則可明顯增加血流切應(yīng)力[20]。本研究結(jié)果顯示，EECP組與對照組相比血清eNOS升高，這一變化可能與EECP增加了血流切應(yīng)力，使血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白增多、內(nèi)皮源性的NO生成增加，從而調(diào)節(jié)重要器官的血流狀態(tài)有關(guān)。

非選擇性抑制NOS活性使CPR后血流動力學(xué)惡化，選擇性抑制iNOS活性也不能改善CPR后的心功能，亦不改善神經(jīng)功能預(yù)后[22]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇后血清iNOS水平由基礎(chǔ)狀態(tài)的低水平明顯升高，說明缺血/再灌注損傷對犬模型的神經(jīng)毒性作用客觀存在。EECP治療可顯著降低CA-ROSC犬血清iNOS水平，提示EECP具有選擇性抑制iNOS的神經(jīng)毒性作用，而適當(dāng)保留其必要的生理功能。

本研究結(jié)果顯示，EECP治療對血清nNOS水平影響無統(tǒng)計學(xué)意義，而nNOS在腦缺血損傷、休克時的多器官功能障礙和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中起到非常重要的毒性作用[23-24]。EECP干預(yù)并不增加復(fù)蘇后nNOS的神經(jīng)毒性作用，考慮亦是增加血流切應(yīng)力，選擇性對內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的良性影響，改善了CA-ROSC后動物模型的腦血流灌注的結(jié)果。

EECP用于CA-ROSC后動物模型，可以在一定程度上增加血清NO水平。其對nNOS、iNOS和eNOS的不同影響，主要是一方面作用于與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)的eNOS，增加相應(yīng)器官血流后改善局部的氧供狀態(tài)；另一方面抑制iNOS的神經(jīng)毒性作用。

總之，將EECP早期用于CA-ROSC后存在內(nèi)皮功能障礙的患者，或可進(jìn)一步改善重要臟器的血管舒縮功能，增加器官血流而不增加NO的神經(jīng)毒性，對ROSC后機體產(chǎn)生有利影響，從而改善CA患者的預(yù)后。

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