大黃附子湯對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜上皮細胞及線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響

康新 梁正凱 路曉光 榪奇 宋建博 王逸 劉杰 范治偉 宋軼 王鵬

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是在臨床常見急腹癥之一，常繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatroy response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS),甚至多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，病情兇險且進展迅速、病死率高[1-2]。SAP后引發(fā)的腸屏障功能障礙所導(dǎo)致的腸源性感染和內(nèi)毒素血癥，是SIRS、MODS由可逆階段向不可逆階段發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是SAP病死率高居不下的主要原因[3-4]。研究表明[5-8]，線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂會導(dǎo)致腸黏膜上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC)能量代謝障礙，繼而使其消化、呼吸、分泌、屏障等功能受到嚴重損害；線粒體功能正常與否，直接影響IEC的存活情況。前期臨床研究表明，傳統(tǒng)中藥方劑大黃附子湯可促進腸蠕動功能的恢復(fù)[9]?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，大黃附子湯能通過升高SAP時IEC線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，維持IEC及其線粒體的超微結(jié)構(gòu)[10]。筆者從線粒體呼吸功能和能量代謝角度，進一步探討大黃附子湯對SAP時IEC及其線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。

資料與方法

一、實驗動物與分組

60只成年健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供。動物采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為：對照組、SAP組與大黃附子湯治療組(大黃附子湯組)，每組20只。每組再按建模后時間(6、12、24、48 h)分為4個亞組(n=5)。在實驗過程中，遵照中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進行。動物實驗經(jīng)過大連大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準。

二、藥品與試劑

大黃附子湯：附子9 g(先煎，產(chǎn)地甘肅)、大黃9 g(后下，產(chǎn)地甘肅)、細辛3 g(產(chǎn)地遼寧)以常規(guī)水煎制成懸濁液，劑量為200 mL(大連大學附屬中山醫(yī)院藥劑科)，置100 ℃水浴消毒80 min，冷卻后置于4 ℃冰箱備用。戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，用無菌0.9%氯化鈉溶液配置成2%戊巴比妥鈉溶液4℃冷藏保存?zhèn)溆?。動物細?組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒(美國，GENMED公司)和純化線粒體細胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase，CcO)活性測定試劑盒(美國，GENMED公司)。?；悄懰徕c(美國，Sigma公司)，用無菌0.9%氯化鈉溶液配置成5%?；悄懰徕c，常溫下現(xiàn)配現(xiàn)用。

三、動物模型制備

術(shù)前所有動物禁食12 h，采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉(1 mL/kg)。麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)備皮、常規(guī)消毒鋪巾，于劍突下上腹正中做切口，切口長約3 cm，暴露肝下間隙，用1 mL注射器針頭刺入胰膽管，并緩慢推注5%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)誘導(dǎo)SAP模型，拔出針頭后，用無菌棉簽輕壓刺入點10 min，見胰腺組織出血壞死后，還納腸袢，關(guān)腹。對照組開腹后，翻動胰腺和十二指腸數(shù)次后關(guān)腹。模型組和大黃附子湯組按上述誘導(dǎo)SAP模型法造模后0、15、30、45 h分別采用0.9%氯化鈉溶液和大黃附子湯保留灌腸(10 mL/kg)，而對照組同時間點給予同體積0.9%氯化鈉溶液灌腸。術(shù)后不限制大鼠活動，術(shù)后6 h禁食水，同時放置于溫暖環(huán)境中(20℃～25℃)。實驗設(shè)計見圖1。

圖1 實驗流程示意圖

四、檢測標本采集

于術(shù)后6、12、24、48 h分別于大鼠左側(cè)股靜脈采血，4℃條件下離心(3 500 r/min，10 min)，取上清，-20℃保存，用于血清淀粉酶和內(nèi)毒素含量測定。動物處死后，切取部分回腸用于分離純化IEC線粒體、IEC線粒體三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和線粒體CcO活性測定以及病理組織學觀察。用無菌刀片刮取2 g回腸上皮黏膜組織，置于預(yù)冷50 mL離心管中，按照動物細胞高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒說明分離與純化IEC線粒體。

五、指標測定

1.血清淀粉酶：用全自動生化儀(57600-010，日立公司，日本)測定血清淀粉酶含量。

2.血清內(nèi)毒素：按照內(nèi)毒素檢測試劑盒(天津一瑞生物工程有限公司)說明書進行操作，采用MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)檢測血漿內(nèi)毒素含量，由標準曲線自動計算出待測血清內(nèi)毒素含量。

3.IEC線粒體ATP合成酶: 采用熒光素—熒光素酶發(fā)光法。反應(yīng)體系有 HEPES緩沖液10 mM、 MgCl22.5 mM、 磷酸鉀緩沖液5 mM、乙二胺四乙酸(EDTA)0.5 mM、0.5 M蘋果酸/0.25 M谷氨酸、熒光素—熒光素酶18 μg，線粒體蛋白為50 μg，反應(yīng)總體積為0.5 mL,pH 7.35～7.45 。記錄以上體系中發(fā)光強度作為本底，加入二磷酸腺苷(ADP)4 μmoL以啟動線粒體 ATP合成反應(yīng)，記錄發(fā)光強度。在不加線粒體及ADP的平行實驗的反應(yīng)體系中，加入(1 nmol)的ATP，記錄發(fā)光強度作為ATP合成量的標定值(酶活力單位：nmol·min-1·mg-1pro)。

4.IEC線粒體CcO: 采用分光光度計法，依照試劑盒說明書進行操作。測定其在550 nm處的吸光度變化，根據(jù)測定結(jié)果來評估CcO活性。用U蛋白標示測定結(jié)果，細胞色素C氧化酶活性單位(U/mg)定義為：在25℃及pH7.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)(每分鐘)氧化1μmol細胞色素C。

5.腸病理組織學檢查：取末端回腸，蘇木精—伊紅染色法(HE)染色后，在光鏡100倍下觀察病理組織學變化。采用小腸上皮損傷指數(shù)[11]評估小腸損傷變化。見表1。

表1 大鼠小腸上皮損傷指數(shù)分級標準

六、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、大黃附子湯對SAP大鼠血清中淀粉酶值的影響

與同時相點對照組結(jié)果相比，SAP組大鼠血清淀粉酶水平在12、24、48 h均增高，(P均<0.001)，6 h時血清淀粉酶增高，差異無統(tǒng)計學(P>0.05)。大黃附子湯組與SAP組比較，大鼠血清淀粉酶在24 h和48 h顯著降低(P<0.01)。結(jié)果見圖2。

注：與對照組比較：aP<0.001，與大黃附子湯組比較：bP<0.01

圖2對照組、SPA組、大黃附子湯組大鼠血清淀粉酶水平的變化

二、大黃附子湯對SAP大鼠血清內(nèi)毒素的影響

SAP后12、24、48 h大鼠血清內(nèi)毒素水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與SAP組相比，大黃附子湯組大鼠血清內(nèi)毒素值在建模后24、48 h均有不同程度下降(P<0.01)。見圖3。

注：與對照組比較：aP<0.01，與大黃附子湯組比較：bP<0.01

圖3對照組、SPA組、大黃附子湯組大鼠血清內(nèi)毒素水平的變化

三、大黃附子湯對SAP大鼠IEC線粒體ATP合成酶活性的影響：

與對照組比較，SAP后6、12、24、48 h IEC線粒體ATP合成酶活性降低且隨病程推移呈遞減趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；經(jīng)大黃附子湯治療后IEC線粒體ATP合成酶活性高于同時間點的SAP組(P<0.05)，原遞減趨勢也得以逆轉(zhuǎn)。見圖4。

注：與對照組比較：aP<0.001，與大黃附子湯組比較：bP<0.05

圖4對照組、SPA組、大黃附子湯組大鼠IEC線粒體ATP合成酶活性的變化

四、大黃附子湯對SAP大鼠IEC線粒體CcO活性的影響

SAP組12、24、48 h線粒體CcO活性低于同時間點對照組的結(jié)果(P均<0.001)，并隨病程的進展逐漸降低。與SAP組相比，大黃附子湯可增加SAP后24 h、48 h線粒體CcO活性，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。見圖5。

五、大黃附子湯對SAP大鼠小腸上皮損傷指數(shù)的影響

與對照組相比，SAP組12 h小腸上皮損傷指數(shù)開始升高(P<0.01)，24、48 h持續(xù)性升高(P均<0.001)。大黃附子湯組可顯著降低SAP后48 h小腸上皮損傷指數(shù)(P<0.001)。見圖6。

注：與對照組比較：aP<0.001，與大黃附子湯組比較：bP<0.01

圖5對照組、SPA組、大黃附子湯組大鼠IEC線粒體CcO活性的變化

注：與對照組比較：aP<0.01，與大黃附子湯組比較：bP<0.001

圖6對照組、SPA組、大黃附子湯組大鼠小腸上皮損傷指數(shù)

討 論

SAP是一種起病急驟、病死率高、發(fā)病機制復(fù)雜的外科急腹癥。腸道是發(fā)生SAP應(yīng)激反應(yīng)的靶器官之一，SAP常并發(fā)腸屏障功能障礙(intestinal barrier dysfunction，IBD)，腸道細菌、內(nèi)毒素經(jīng)受損的腸黏膜進入體循環(huán)而繼發(fā)腸源性內(nèi)毒素血癥，誘發(fā)和加重SIRS和MODS，導(dǎo)致較高死亡率[12-14]。因此，SAP的高死亡率與腸道功能失常密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胰膽管注射5%?；悄懰徕c后血清淀粉酶、內(nèi)毒素均有顯著增高；SAP后12 h小腸上皮損傷指數(shù)開始顯著高于同時間點對照組，隨后的24 h和48 h升高更為顯著。這些結(jié)果均表明，?；悄懰徕c在胰膽管注射誘發(fā)SAP的同時，小腸上皮也并發(fā)損傷。

IEC的生理功能失常或死亡，腸道機械屏障、生物屏障等功能就會出現(xiàn)障礙或消失。腸上皮細胞、潘氏細胞、杯狀細胞、內(nèi)分泌細胞和未分化細胞組成腸黏膜上皮細胞，腸道屏障功能在很大程度上取決于IEC的功能正常與否。如果IEC結(jié)構(gòu)被破壞，腸道屏障功能隨之消失，腸道就失去了它原有的隔離作用，使致病菌、毒素以及腸內(nèi)物質(zhì)可通過這些屏障進入血液循環(huán)。線粒體是細胞能量的產(chǎn)生中樞。機體內(nèi)超過90%的氧在線粒體內(nèi)被利用：通過氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為 ATP。故線粒體是細胞內(nèi)呼吸作用和產(chǎn)生ATP的主要場所，是維護細胞生命的重要細胞器。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能紊亂會導(dǎo)致IEC能量代謝障礙，繼而使其消化、呼吸、分泌、屏障等功能受到嚴重損害。且線粒體功能的正常與否，直接關(guān)系到IEC的存亡。

ATP作為最重要的能量分子在細胞的各種生理、病理過程中起著重要作用[16]。通常細胞在凋亡、壞死或處于一些毒性狀態(tài)下，ATP合成酶水平會下降。ATP水平的下降表明線粒體的功能受損。線粒體呼吸鏈復(fù)合體起著電子傳遞和質(zhì)子泵出的作用，將氧化底物的質(zhì)子氧化還原勢能轉(zhuǎn)化為跨線粒體內(nèi)膜的電勢能，用于驅(qū)動ATP合成。ATP合成酶的主要功能是利用電勢能催化ADP與磷酸分子(Pi)合成ATP。H+-ATP酶合成活性的降低，將影響這一過程的效率[17-18]。本實驗結(jié)果顯示，SAP后6 h、12 h、24 h和48 h IEC線粒體ATP合成酶活性呈遞減趨勢，表明SAP后IEC線粒體H+-ATP酶利用ΔP催化合成ATP的能力降低，細胞發(fā)生能量代謝障礙。CcO存在于真核生物的線粒體上，在線粒體表面參與呼吸氧化作用，是呼吸電子傳遞鏈的第4個中心酶復(fù)合物，在細胞呼吸中處于細胞色素系統(tǒng)的末端，把呼吸底物的電子經(jīng)過細胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧。作為線粒體外膜功能的生物標記，通過測定CcO活性變化，可衡量線粒體外膜的完整性、評估線粒體的損害程度。本研究結(jié)果顯示，SAP后12、24、48 h大鼠IEC線粒體CcO活性較對照組逐漸降低，表明SAP時IEC外膜完整性被破壞、線粒體結(jié)構(gòu)受損。因此，SAP可造成IEC線粒體結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致呼吸功能紊亂，進而ATP合成減少、CcO活性降低，最終致IEC死亡，腸屏障功能損害。

大黃附子湯源自漢代張仲景的《金匱要略》，由大黃、附子、細辛組成，含大黃素、烏頭堿和細辛醚等有效成分，具有溫里散寒，通便止痛之功效。現(xiàn)常用于治療急性腸梗阻、胰腺炎、膽囊術(shù)后綜合征等[9,19-20]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為，大黃附子湯的通便作用是由大黃苦寒的藥性引起瀉下所致?，F(xiàn)代藥理學研究證實，大黃酸苷等成分具有刺激腸黏膜下神經(jīng)叢，使腸蠕動亢進的作用[21]。方中附子大辛大熱，溫陽祛寒為君藥，附子主要含有次烏頭堿等多種生物堿，具有強心、升壓、抗休克、抗缺氧、擴張外周血管、拮抗炎癥反應(yīng)的作用。佐藥細辛辛散溫通。方中大黃能佐制附子的毒性，細辛的主要成分細辛醚具有緩解烏頭堿毒性的功效。因此，大黃附子湯中三藥合用相反相成，共同奏效。大黃附子湯摒棄長期以來重癥急性胰腺炎中藥治療以“峻下、寒涼”為主，單純清熱解毒、活血攻下的用藥特點，轉(zhuǎn)而“溫下”為主，寒熱并用，溫補通下并施，通下而不傷陽氣。路小光等研究表明，大黃附子湯保留灌腸能顯著增加SAP患者腸鳴音，改善胃腸功能評分及APACHEII評分，此外大黃附子湯還可能降低SAP患者血漿DAO活性和D～乳酸水平，保護腸黏膜免受損傷，保護腸道完整性，明顯降低腸壁通透性[9]。本研究從線粒體呼吸功能和能量代謝角度著手，研究了大黃附子湯對SAP大鼠線粒體ATP合成酶和CcO活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，大黃附子湯可顯著增強IEC線粒體ATP合成酶活性和線粒體CcO活性，逆轉(zhuǎn)SAP后大鼠IEC線粒體呼吸功能和能量代謝的下降。同時，本研究也提示，大黃附子湯顯著降低SAP后48 h小腸上皮損傷指數(shù)，降低血清淀粉酶和內(nèi)毒素含量，緩解SAP病情。吳麗等研究發(fā)現(xiàn)，大黃附子湯能減少SAP大鼠內(nèi)毒素移位吸收，顯著改善SAP大鼠腸道及胰腺的病理改變[22]。

綜上所述，SAP后大鼠IEC線粒體ATP合成酶和CcO活性均顯著下降，存在細胞能量代謝和呼吸功能障礙，大黃附子湯能通過增強大鼠IEC線粒體ATP合成酶和CcO活性，保護SAP后IEC的損傷，降低血清淀粉酶及內(nèi)毒素含量，緩解SAP病情。

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