大黃素在低氧腸應(yīng)激損傷中細(xì)胞自噬的保護(hù)作用

鄭　英， 哈小琴， 王怡君， 王　娟， 高彩燕

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州　730000; 2.蘭州軍區(qū) 蘭州總醫(yī)院, 甘肅 蘭州　730050; 3.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院， 甘肅 蘭州　730030)

?

大黃素在低氧腸應(yīng)激損傷中細(xì)胞自噬的保護(hù)作用

鄭英1， 哈小琴2*， 王怡君2， 王娟3， 高彩燕3

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州730000; 2.蘭州軍區(qū) 蘭州總醫(yī)院, 甘肅 蘭州730050; 3.蘭州大學(xué) 第二醫(yī)院， 甘肅 蘭州730030)

摘要：研究了大黃素在低氧腸應(yīng)激損傷中通過細(xì)胞自噬機(jī)制如何起保護(hù)作用.以IEC-6細(xì)胞為研究對(duì)象，采用噻唑藍(lán)染色法(MTT)篩選出最佳大黃素濃度.在常氧(氧濃度20.9%)及低氧環(huán)境下(氧濃度5%)6 h、24 h后，用噻唑藍(lán)染色法(MTT)檢測(cè)其細(xì)胞存活率；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，并通過實(shí)時(shí)熒光定法(Real-Time PCR)檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin-1及LC3的表達(dá).噻唑藍(lán)染色法(MTT)結(jié)果表明，與常氧對(duì)照組相比，在低氧條件下無大黃素組細(xì)胞生存率明顯降低(P<0.01)，而大黃素組細(xì)胞生存率無明顯差異(P>0.05)；流式細(xì)胞儀結(jié)果表明,相對(duì)于無大黃素組，大黃素組可明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期(P<0.01)；Real-Time PCR結(jié)果表明，在低氧6 h、24 h后大黃素組Beclin-1及LC3基因表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05).可知在低氧腸應(yīng)激性損傷下，大黃素通過自噬機(jī)制起保護(hù)作用.

關(guān)鍵詞：自噬； 低氧； 腸應(yīng)激性損傷； 大黃素； 保護(hù)

0引言

高原低氧是造成腸道應(yīng)激性損傷的主要原因之一.低氧可誘發(fā)自噬[1].自噬是一種細(xì)胞保持自身穩(wěn)態(tài)及存活的機(jī)制，它通過形成的自噬溶酶體不斷降解細(xì)胞內(nèi)的各種成分并提供可循環(huán)利用的必需原料，從而最大程度地維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)[2].自噬(Autophagy)是低氧條件下保護(hù)細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)的自噬促進(jìn)細(xì)胞在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下的存活[3].已有研究發(fā)現(xiàn)，自噬存在于低氧腸應(yīng)激性損傷中[4]，但其具體分子機(jī)制及信號(hào)通路仍未完全研究清楚，尤其是自噬在低氧腸應(yīng)激性損傷中的作用尚存在較大爭(zhēng)議.

大黃素是一種從掌葉大黃的根莖中所提取到的羥基蒽醌類化合物，其具有多種功效，如抑菌、抗炎、改善微循環(huán)、抗癌等，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值[5].已有研究證明，大黃素對(duì)于腸道黏膜屏障損傷有明顯的保護(hù)作用[6]，但其具體分子機(jī)制仍然未能完全研究清楚.

在低氧條件下，腸道作為全身最大的免疫器官，其自身的自穩(wěn)功能對(duì)全身的保護(hù)起著舉足輕重的作用[7].本文以大鼠腸上皮隱窩細(xì)胞IEC-6為研究對(duì)象，篩選出最佳大黃素濃度，在低氧環(huán)境下行MTT、細(xì)胞周期檢測(cè)明確大黃素對(duì)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，在基因水平上檢測(cè)自噬相關(guān)基因，從而闡明在低氧腸應(yīng)激性損傷下，大黃素可能通過增強(qiáng)自噬機(jī)制而起保護(hù)作用.目前，本研究工作在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中罕見報(bào)道.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料

大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6細(xì)胞株，購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù)；大黃素，購(gòu)自于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；高糖DMEM培養(yǎng)基干粉，Gibco公司；胎牛血清，Hyclone公司；胰蛋白酶，Gibco公司；碘化丙啶、四甲基偶氮唑藍(lán)、二甲基亞楓，購(gòu)于Sigma公司.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞株IEC-6細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1.0×105U/L 青霉素和鏈霉素等的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、飽和濕度5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合，經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，按1∶2比例進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

1.2.2大黃素最佳濃度篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞加入96孔板中，每孔加入4×104個(gè)/mL細(xì)胞，終體積為100 uL，置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度大黃素40μmol/L、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L，同時(shí)設(shè)立對(duì)照孔，分別平行3個(gè)復(fù)孔.

各組分別培養(yǎng)72 h 后，棄上清，加20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 150μL，置震蕩器振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A)值.

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%

1.2.3低氧處理后細(xì)胞存活率檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞加入96孔板中，每孔加入4×104個(gè)/mL細(xì)胞，終體積為100μL，對(duì)照孔加入5%FBS培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含最佳大黃素濃度的5%FBS培養(yǎng)液，48小時(shí)后，置于氧濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中0 h、6 h、24 h后，棄上清，加20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 150μL，置震蕩器振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度(A)值.

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%

1.2.4細(xì)胞周期檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞加入25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×106個(gè)/mL細(xì)胞，對(duì)照孔加入5%FBS培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含最佳大黃素濃度的5%FBS培養(yǎng)液，48小時(shí)后，置于氧濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中0 h、6 h、24 h后，棄上清，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，收集細(xì)胞置離心管，9 000 r/min 離心3 min，冷PBS洗3 次，用75%乙醇1 mL固定過夜，PI 染液(含5 mg PI、2 mg RnaseA、500μL 1% TritonX-100、100 mg 枸櫞酸鈉、5 mL 0.9% 生理鹽水、加三蒸水至100 mL)，室溫下避光染色15 min，400目篩網(wǎng)濾過，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA含量，分析細(xì)胞周期.

結(jié)果用ModFit 軟件分析.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5自噬相關(guān)基因檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期IEC-6細(xì)胞加入25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入1×106個(gè)/mL細(xì)胞，對(duì)照孔加入5%FBS培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含最佳大黃素濃度的5%FBS培養(yǎng)液，48小時(shí)后，置于氧濃度為5%的三氣培養(yǎng)箱中0 h、6 h、24 h后，棄上清，使用TRIzol法提取RNA，紫外分光度儀上測(cè)RNA的純度及濃度.

使用試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄體系.ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System 進(jìn)行PCR.結(jié)果用2^-△△Ct法分析.

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果與討論

2.1不同濃度大黃素對(duì)細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，隨著大黃素濃度的增加,細(xì)胞存活率先升高后降低，在濃度為5μmol/L時(shí)具有明顯促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，其結(jié)果如圖1所示.

圖1　不同濃度大黃素的細(xì)胞存活率

2.2低氧下Beclin-1、LC3基因的表達(dá)

如表1所示，Real-Time PCR結(jié)果顯示：與常氧對(duì)照組相比，低氧6小時(shí)、24小時(shí)后自噬相關(guān)基因Beclin-1及LC3表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05).

低氧6小時(shí)后,Beclin-1基因表達(dá)量為：無大黃素組是常氧對(duì)照組的12.64倍，大黃素組是常氧對(duì)照組的25.26倍；LC3基因表達(dá)量為：無大黃素組是常氧對(duì)照組的5.63倍，大黃素組是常氧對(duì)照組的12.05倍.

低氧24小時(shí)后，Beclin-1基因表達(dá)量為：無大黃素組是常氧對(duì)照組的22.62倍，大黃素組是常氧對(duì)照組的17.60倍；LC3基因表達(dá)量為：無大黃素組是常氧對(duì)照組的3.09倍，大黃素組是常氧對(duì)照組的6.04倍.

可見，相對(duì)于常氧對(duì)照組,在低氧6小時(shí)后,大黃素組Beclin-1及LC3基因表達(dá)量較無大黃素組明顯增多(P<0.05)；而在低氧24小時(shí)后，大黃素組Beclin-1基因表達(dá)低于無大黃素組(P>0.05)，大黃素組LC3基因表達(dá)高于無大黃素組(P<0.01).

低氧24小時(shí)與低氧6小時(shí)后相比，大黃素組Beclin-1及LC3表達(dá)量均降低(P<0.01).24小時(shí)后的Beclin-1基因表達(dá)量與6小時(shí)后相比，大黃素組相對(duì)于無大黃素組有下降(P>0.05)；24小時(shí)后的LC3基因表達(dá)量與6小時(shí)后相比，大黃素組高于無大黃素組(P<0.01).

表1　自噬相關(guān)基因表達(dá)

注：*與常氧對(duì)照組相比,P<0.05;△與低氧24小時(shí)后無大黃素組相比,P>0.05;##與低氧24小時(shí)后無大黃素組相比，P<0.01;%%與低氧6小時(shí)后大黃素組相比,P<0.01

2.3大黃素對(duì)IEC-6細(xì)胞存活率的影響

如表2～3所示，分別在低氧6小時(shí)、24小時(shí)后，無大黃素組與常氧對(duì)照組相比存活率明顯降低(P<0.01)，大黃素組與常氧對(duì)照組相比存活率沒有明顯差異(P>0.05).結(jié)果顯示，在低氧條件下，大黃素對(duì)IEC-6細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，能明顯地促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng).

表2　無大黃素組與常氧對(duì)照組相比存活率

注：**與常氧對(duì)照組相比，P<0.01

注：△與常氧對(duì)照組相比，P>0.05

2.4大黃素對(duì)細(xì)胞周期的影響

如表4所示，細(xì)胞周期顯示：與常氧對(duì)照組相比，低氧下大黃素組較無大黃素組處于S期細(xì)胞明顯增多(P<0.01)，提示大黃素可明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期.

表4　大黃素組與常氧對(duì)照組細(xì)胞周期比較

注：**與常氧對(duì)照組相比，P<0.01.

3結(jié)論

隨著海拔的升高，大氣壓下降，引起氧分壓降低，從而導(dǎo)致低比重的缺氧[8].高原低氧是腸道黏膜屏障應(yīng)激性損傷的主要原因之一.高原低氧所致腸粘膜屏障的損傷可引起腸道功能紊亂，甚至誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合癥并危及生命[9].應(yīng)激性是指在短時(shí)間內(nèi)機(jī)體對(duì)外界刺激所作出的全身非特異性反應(yīng)，其目的是使機(jī)體適應(yīng)環(huán)境.自噬(Autophagy)是缺氧條件下保護(hù)細(xì)胞的一種應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)自噬可促進(jìn)細(xì)胞在缺血缺氧等饑餓狀態(tài)下的存活[3].已有研究表明，大黃素對(duì)于腸道黏膜屏障損傷有保護(hù)作用[6].因此，本研究對(duì)大黃素在低氧腸道應(yīng)激性損傷的保護(hù)作用是否與增強(qiáng)細(xì)胞自噬機(jī)制有關(guān)進(jìn)行了研究.

本研究經(jīng)MTT法篩選出大黃素對(duì)IEC-6細(xì)胞的最佳促生長(zhǎng)作用的濃度為5μmol/mL.分別對(duì)大黃素組、無大黃素組在低氧6小時(shí)、24小時(shí)后的自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3的表達(dá)進(jìn)行了研究，Beclin-1與LC3基因被認(rèn)為與自噬活動(dòng)密切相關(guān)[10-13].

Real-Time PCR結(jié)果顯示，低氧6小時(shí)及24小時(shí)后，相對(duì)于常氧對(duì)照組，大黃素組和無大黃素組的Beclin-1、LC3基因的表達(dá)量均上調(diào)(P<0.01).尤其在低氧6小時(shí)后，大黃素組的Beclin-1與LC3基因表達(dá)量相對(duì)無大黃素組明顯增多(P<0.01)，提示低氧引起急性應(yīng)激時(shí)大黃素可促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生.低氧24小時(shí)與低氧6小時(shí)后相比，大黃素組Beclin-1及LC3表達(dá)量均降低(P<0.01)，說明在低氧較短時(shí)間內(nèi)(6小時(shí))，大黃素組明顯增強(qiáng)了自噬相關(guān)基因Beclin-1與LC3的表達(dá).

低氧條件下，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示大黃素具有明顯保護(hù)細(xì)胞、促細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示相比較無大黃素組，大黃素可明顯促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期.

綜上所述，我們可以推測(cè)，大黃素在低氧條件下，尤其在短時(shí)期內(nèi)(6小時(shí))對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞的自噬機(jī)制來進(jìn)行的，最終促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期，使得整個(gè)內(nèi)環(huán)境在受到損害后仍處于正常狀態(tài).但關(guān)于大黃素的具體作用位點(diǎn)及相關(guān)的信號(hào)通路仍不清楚，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)這一部分進(jìn)行深入研究.

近年來，由于突發(fā)事件、嚴(yán)重自然災(zāi)害等，在西部高海拔地區(qū)作業(yè)人員越來越多，而高海拔低氧是引起高原疾病尤其是腸粘膜屏障損傷的最主要應(yīng)激因素[14].對(duì)于低氧所致的全身應(yīng)激性疾病，腸道功能的恢復(fù)已經(jīng)作為重要的治療指標(biāo)之一[15].因此，研究新型、高效且適用于高海拔腸應(yīng)激損傷防治的藥物，已成為當(dāng)今生命科學(xué)亟待解決的問題之一.在腸道應(yīng)激性損傷中，自噬的調(diào)節(jié)已經(jīng)成為了一個(gè)有潛力的治療目標(biāo).

參考文獻(xiàn)

[1] Blagosklonny M V.Hypoxia,mtor and autophagy converging on senescence or quiescence[J].Autophagy,2013,9(2):260-264.

[2] Ohsumi Y.Historical landmarks of autophagy research[J].Cell Research,2014,24(1):9-23.

[3] Stefan W.Rytera Amkc.Autophagy:An Integral component of the mammalian stress response[J].J Biochem Pharmacol Res,2013,1(3):176-188.

[4] Kroemer G,Marino G,Levine B.Autophagy and the integrated stress response[J].Molecular cell,2010,40(2):280-293.

[5] 熊興富.中藥大黃主要有效成分藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(10):143-146.

[6] 丁博文,嵇武,白小武,等.大黃素對(duì)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].東南國(guó)防醫(yī)藥,2012,14(3):199-202.

[7] Yoshiyuki Goto H K.Epithelial barrier:An interface for the cross-communication between gut flora and immune system[J].Immunological Reviews,2012,245:147-63.

[8] Chris Imray A W,Andrew Subudhi,Robert Roach.Acute mountain sickness:Pathophysiology,prevention,and treatment[J].Progress in Cardiovascular Diseases,2010,52(6):467-484.

[9] 楊定周,周其全, 李素芝.高原缺氧致急性胃腸黏膜損傷及其與多器官功能障礙綜合征的關(guān)系[J].高原醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(3):44-45.

[10] Wirawan E,Lippens S,Vanden Berghe T,et al.Beclin-1:A role in membrane dynamics and beyond[J].Autophagy,2012,8(1):6-17.

[11] Fu L L,Cheng Y,Liu B.Beclin-1:Autophagic regulator and therapeutic target in cancer[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology,2013,45(5):921-924.

[12] Green D R,Levine B.To be or not to be?How selective autophagy and cell death govern cell fate[J].Cell,2014,157(1):65-75.

[13] Slobodkin M R,Elazar Z.The atg8 family:Multifunctional ubiquitin-like key regulators of autophagy[J].Essays in Biochemistry,2013,55:51-64.

[14] 楊定周,周其全,李素芝.胃腸粘膜屏障損傷與高原多器官功能障礙綜合征[J].西南國(guó)防醫(yī)學(xué),2008,18(2):295-298.

[15] 伍民生，梁健.重癥監(jiān)護(hù)病房危重患者腸功能障礙診治進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(2):326-329.

Emodin in hypoxic intestinal stress damage

and the protection of autophagy

ZHENG Ying1， HA Xiao-qin2*， WANG Yi-jun2， WANG Juan3， GAO Cai-yan3

(1.Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and The Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Colleges and Universities， Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2.Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region, Lanzhou 730050, China； 3.The Second Hospital, Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

Abstract:Research on emodin in hypoxia stress damage,which protect the cell through the autophagy system.IEC-6 cells as the research object,selects the best concentration of emodin by MTT method,respectively under the constant oxygen (20.9% oxygen concentration) and low oxygen (5% oxygen concentration) after 6 h and 24 h,tests cell survival rate by MTT,detects the cell cycle using flow cytometry instrument,and tests autophagy related genes by Real Time-PCR.MTT results suggest:compared with the control group，under the condition of low oxygen without emodin group cell survival rate was significantly lower (P<0.01);No significant difference was observed between the control group and emodin group (P>0.05).Flow cytometry results suggest:emodin group can obviously promote cell into the split phase (P<0.01).Real-Time PCR results suggest:at low oxygen after 6 hours and 24 hours, the expressions of Beclin-1 and LC3 gene expression increased significantly (P<0.05) in emodin group.In hypoxia stress damage, emodin may as a protector through the autophagy system.

Key words:autophay; hypoxia; intestinal stress damage; emodin; protection

中圖分類號(hào)：R574

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2015)02-0134-05

通訊作者:

作者簡(jiǎn)介:鄭英(1983-)，女，甘肅天水人，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)哈小琴(1968-)，女，甘肅隴南人，主任醫(yī)師，博士，研究方向：干細(xì)胞及基因藥物,842917389@qq.com

基金項(xiàng)目：甘肅省科技廳杰出青年科技基金項(xiàng)目(1111RJDA004)

收稿日期:*2014-12-13