促紅細(xì)胞生成素原核表達(dá)載體構(gòu)建分離純化

促紅細(xì)胞生成素原核表達(dá)載體構(gòu)建分離純化*

馬麗婷1高秀峰1王胤吉1潘佳欣1趙佳皓1陽(yáng)文龍2李永生3

(1．四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；2.四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院； 3.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院， 四川 成都 610041)

【摘要】目的構(gòu)建和表達(dá)人源性促紅細(xì)胞生成素(EPO)，為促紅細(xì)胞生成素發(fā)揮功能與結(jié)構(gòu)差異研究做準(zhǔn)備。方法通過(guò)NCBI查找人源性促紅細(xì)胞生成素全基因序列并合成，構(gòu)建原核表達(dá)載體pTWIN1-rhEPO，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得高效表達(dá)重組轉(zhuǎn)化子菌株。結(jié)果成功構(gòu)建人源性促紅細(xì)胞生成素原核表達(dá)載體，經(jīng)酶切和DNA序列測(cè)序分析，結(jié)果表明該基因序列與合成序列完全相同。終濃度0.5mmol/L ITPG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳分析，4小時(shí)時(shí)蛋白表達(dá)量最高。結(jié)論構(gòu)建和表達(dá)重組載體pTWIN1-rhEPO，分離純化出目的蛋白，為進(jìn)一步研究促紅細(xì)胞生成素組織修復(fù)功能及突變體相關(guān)功能研究奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】促紅細(xì)胞生成素； 表達(dá)載體構(gòu)建； 原核表達(dá)； 分離純化

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 331.1+4【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1103604)

通訊作者：高秀峰 教授 博士生導(dǎo)師 郵箱：Xiufengg@163.com

收稿日期：( 2015-01-07； 編輯： 張文秀)

Vector construction, expression and purification of erythropoietinMA Liting1, GAO Xiufeng1, WANG Yinji1,etal

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,WestChinaSchoolofPreclinicalandForensic

Medicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;

2.WestChinaSchoolofMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;

3.SchoolofChemicalEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract【】ObjectiveTo construct and express the human-derived erythropoietin in order to study the differences in structure and function for the further research. MethodsThe rhEPO sequence was identified through NCBI and was synthesized, constructed Prokaryotic expression vector pTWIN1-rhEPO, transformed into E. coli BL21 (DE3), to obtain efficient expression of recombinant transformant strains respectively. ResultsSuccessfully constructed human-derived erythropoietin prokaryotic expression vector, as a result of digestion and DNA sequencing analysis showed that the gene sequence was identical with the synthetic sequence. The final concentration of 0.5mmol/L IPTG was used to induce protein expression, SDS-PAGE electrophoresis analysis, protein expression was highest at 4h. ConclusionConstructed and expressed the Prokaryotic expression vector pTWIN1-rhEPO, utilized chitin affinity chromatography to separate and purify of rhEPO, for further study of erythropoietin tissue repair functions and the mutants’ related functions do research foundation.

【Key words】Erythropoietin; Expression vector construction; Prokaryotic expression; Separation and purification

促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)是細(xì)胞因子家族的成員之一，是糖蛋白類(lèi)激素。主要功能是刺激骨髓的紅系祖細(xì)胞分裂、分化為成熟的紅細(xì)胞[1]。EPO受體(Erythropoietin Receptor, EPOR)不僅分布在骨髓造血系統(tǒng),還廣泛分布在非造血組織[2]。近年發(fā)現(xiàn)其還具有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、血管的再生和創(chuàng)面再生等效應(yīng)[3]，特別是在腦損傷的神經(jīng)保護(hù)中起重要作用，已成為研究熱點(diǎn)之一。但是，將EPO用于臨床組織損傷治療，會(huì)帶來(lái)血液粘稠、血栓形成、高血壓等副作用。因此，近年也有氨甲?；疎PO、EPO定點(diǎn)突變、EPO模擬肽等無(wú)促紅細(xì)胞生成作用的EPO衍生物的相關(guān)報(bào)道[4]。本研究擬利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造rhEPO構(gòu)建其突變體，希望表達(dá)的重組蛋白能夠?qū)Υ偌t細(xì)胞生成素受體的親和力下降，對(duì)神經(jīng)組織表面的異源βcR的親和力增強(qiáng)，達(dá)到對(duì)神經(jīng)組織修復(fù)和保護(hù)作用的同時(shí)減少因紅細(xì)胞生成過(guò)多導(dǎo)致的血液粘稠、血栓形成等副作用，為心、腦血管、組織損傷的治療，以及藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此階段的研究是構(gòu)建EPO原核表達(dá)載體，篩選工程菌；并對(duì)表達(dá)EPO進(jìn)行分離純化，為進(jìn)一步的突變和功能研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1rhEPO基因、菌株及載體rhEPO全基因由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，目的片段連接在pBLUE克隆載體上；DH5α購(gòu)于全式金科技(北京)有限公司，E.coli BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；原核表達(dá)載體p-TWIN1購(gòu)于成都金線科技有限生物公司。

1.1.2試劑質(zhì)粒小量抽取試劑盒和瓊脂糖回收試劑盒由Axygen生物技術(shù)公司生產(chǎn)；酵母提取物和胰蛋白胨由OXOID公司生產(chǎn)；IPTG由生工生物工程有限公司進(jìn)口分裝；trans 2K plus II DNA Marker、PrimeStars DNA聚合酶由寶生物工程有限公司生產(chǎn)；T4 DNA連接酶、NcoI、BamHI限制性?xún)?nèi)切酶由Thermo Fisher科技公司生產(chǎn)；幾丁質(zhì)親和層析柱購(gòu)于NEB公司；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒DNA小量提取根據(jù)《質(zhì)粒小量抽取試劑盒說(shuō)明書(shū)》進(jìn)行操作。

1.2.2rhEPO基因與原核表達(dá)載體pTWIN1連接與轉(zhuǎn)化將提取的質(zhì)粒在37℃水浴下，NcoI和BamHI雙酶切過(guò)夜。經(jīng)1%瓊脂糖電泳，膠回收目的片段rhEPO和pTWIN1大片段，經(jīng)22℃水浴下，T4連接酶，連接1小時(shí)，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，涂平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單菌落活化，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)從克隆菌中提取出重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)，將工程菌菌落于液體LB中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，接種到新LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3h，0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)下表達(dá)4h。離心收集沉淀，重懸于高純水，超聲破粹，離心收集上清獲得粗蛋白液，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4重組蛋白rh-epo分離純化。將工程菌接種于250mlLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD值約為0.5，加入0.5mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，4℃離心收集菌體，加入10ml細(xì)胞裂解液B1(20mM Tris-Hcl,1mM EDTA,50mM Nacl,PH為8.5)重懸菌體，冰浴超聲破菌。破菌后菌液以12000g離心30分鐘，取上清，流速為0.5~1ml/min上樣于經(jīng)過(guò)B1平衡后的幾丁質(zhì)柱，收集穿出液；再用20倍柱體積B1裂解液平衡洗去未結(jié)合雜蛋白，快速加入誘導(dǎo)自剪切緩沖液B2(20mM Tris-Hcl,1mM EDTA,50mM Nacl,pH為5.5)，在室溫條件下誘導(dǎo)自剪切過(guò)夜。過(guò)夜后用B1緩沖液洗脫目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。

2結(jié)果

2.1p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化瓊脂糖凝膠電泳圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1p-BLUE-rhEPO和pTWIN大片段基因純化

Fig.1Purification of E.coil DH5α-pBLUE-rhEPO and E.coil DH5α-pTWIN1 gene segments

注：M:DNA Ladder; 1.pTWIN1基因片段；2.rh-EPO和pBULE-rhEPO基因片段

2.2重組pTWIN1-rhEPO的構(gòu)建將上述純化并獲得的基因大片段利用T4連接酶連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α，提取重組質(zhì)粒，雙酶切和測(cè)序鑒定。見(jiàn)圖2雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖譜。

圖2E.coil DH5α-pTWIN1-rhEPO 重組子 酶切鑒定

Fig.2Verification of positive clone with E.coli DH5α-pTWIN1-rhEPO by RE digestion

注：M:DNA Ladder; 1、2:E.col; DH5α-PTWIN1-rhEPO陽(yáng)性克隆雙酶切，3:E.coli DH5α-pTWINI陽(yáng)性克隆雙酶切

2.3含有pTWIN1-rhEPO質(zhì)粒表達(dá)菌的構(gòu)建將經(jīng)鑒定成功的重組質(zhì)粒pTWIN1-rhEPO 轉(zhuǎn)化到E.coil BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定，結(jié)果如圖3所示，該菌為表達(dá)菌重組子。

2.4rhEPO重組蛋白表達(dá)在37℃，120rpm轉(zhuǎn)速的搖床下，用250ml三角瓶裝有50ml LB液體培養(yǎng)基接種500μl過(guò)夜擴(kuò)0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5h，使細(xì)

圖3pTwin1-rhEPO重組子雙酶切鑒定

Fig.3Verification of pTwin1-rhEPO by RE digestion.

注：M:DNA Ladder; 1、2：pTWINI-rhEPO雙酶切

菌產(chǎn)生重組蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，生長(zhǎng)時(shí)間為4h時(shí)，蛋白表達(dá)量最大。培養(yǎng)菌液，設(shè)定生長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為1h、2h、3h、4h、5h，然后加入終濃度為加入終濃度為0.5mmol/L IPTG,37℃,120rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)5h，使細(xì)菌產(chǎn)生重組蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,可知其最適表達(dá)蛋白條件為當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)OD600=0.5~0.7時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L IPTG,37℃,120rpm轉(zhuǎn)速, 最適生長(zhǎng)時(shí)間為4h時(shí)，蛋白表達(dá)量最大。

圖4E.coliBL21(DE3)-pTWIN1-rhEPO表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.4SDS-PAGE analysis of the recombinant protein produced by E.coli BL21(DE3)-pTWIN1-rhEPO

注：M:蛋白標(biāo)記；0:E.col BL21(OE3)蛋白表達(dá)；1-5：1、2、3、4、5小時(shí)蛋白表達(dá)

2.5重組蛋白rhEPO初步分離純化原核表達(dá)載體pTWIN1-rhEPO表達(dá)的融合蛋白含有的幾丁質(zhì)結(jié)合域 (chitin-binding domain，CBD)和內(nèi)含肽1(intein1)。CBD可與幾丁質(zhì)親和層析柱特異性結(jié)合，intein1在pH為5.5，室溫條件下，對(duì)rhEPO的N末端發(fā)生自剪切，目的蛋白rhEPO與CBD-intein1蛋白脫離，rhEPO游離于平衡液中，得到純化的rhEPO分子量約為18KD(見(jiàn)圖5)，與理論推導(dǎo)的分子量18Kd相符。

圖5純化的rhEPO的SDS-PAGE分析

Fig.5SDS-PAGE of rhEPO. M: protein marker;

注：rhEPO純化色譜；2:E.coliBL21蛋白表達(dá)；3:IPTG蛋白表達(dá)

3討論

促紅細(xì)胞生成素是一種含唾液酸的糖蛋白，由一條多肽鏈，166個(gè)氨基酸殘基組成，含有兩個(gè)二硫鍵，形成4個(gè)穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)，分子量為18 kD，約30%~40%是糖基，其主要是甘露糖、巖藻糖和唾液酸等，它們?cè)诰S持EPO分子活性、防止EPO失活等方面具有重要作用。人EPOR是由484個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，它是細(xì)胞超家族和生長(zhǎng)因子受體中的一員，其結(jié)構(gòu)分為三部分：跨膜區(qū)、胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，高度保守的近膜區(qū)WSXSW結(jié)構(gòu)是胞內(nèi)信號(hào)分子結(jié)合位點(diǎn)的必須組成部分，起到與EPO特異結(jié)合并激活一系列信號(hào)通路的作用[4]。EPO誘導(dǎo)的紅祖系細(xì)胞和前體細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)是通過(guò)同源二聚體EPOR實(shí)現(xiàn)[5,6]。EPO與EPOR結(jié)合后，EPOR形成二聚體，偶聯(lián)酪氨酸激酶(Janus tyrosine kinase-2, JAK2)，激活JAK2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子、轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription-5,STAT5)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)和核因子κB，啟動(dòng)下游一系列因子,包括釋放各種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞增埴、分化等[7]。腎臟及其他器官中存在β-common receptor(βcR, CD131)，系GM-CSF、IL-3 和IL-5 的受體共同亞單位，能與EPOR形成異源二聚體，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和組織保護(hù)作用，但不啟動(dòng)造血信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。EPO有4個(gè)α螺旋(A-D)，根據(jù)EPO與EPOR結(jié)合后的晶體結(jié)構(gòu)，在C螺旋上，有6個(gè)位點(diǎn)Lys97、Ser100、Arg103、Ser104、Thr107、Leu108是與EPOR主要結(jié)合的位點(diǎn)[9,10]，EPO氨基序列(1-17)、內(nèi)部(99-109)羧基末端(147-151)，及上述提及的幾個(gè)位點(diǎn)在發(fā)揮促紅作用時(shí)至關(guān)重要；國(guó)內(nèi)外目前的主要研究是將以上重要位點(diǎn)進(jìn)行氨甲酰化修飾、去唾液酸化[11,12]及定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)氨甲?；腅PO無(wú)促紅作用而具有組織保護(hù)修復(fù)作用，其具體作用機(jī)制尚不清楚。

4結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pTWIN1-EPO，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)利用0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)EPO表達(dá)，并成功利用幾丁質(zhì)親和層析分離純化出該蛋白，在此基礎(chǔ)上將要構(gòu)建促紅細(xì)胞生成素突變載體并表達(dá)，為進(jìn)一步研究EPO組織修復(fù)功能及突變體相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

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