胃癌相關(guān)甲基化分型與幽門(mén)螺桿菌感染的探討*

朱衛(wèi)華，劉繼斌，林 蘭(江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院，江蘇南通 226361)

胃癌(GC)是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。胃癌預(yù)后差仍然是一個(gè)重要的臨床挑戰(zhàn)，它對(duì)放療和化療相對(duì)耐藥因而治療選擇有限[2]。DNA甲基化(DNA methylation)是目前研究最為廣泛、最重要的表觀遺傳修飾之一。腫瘤甲基化亞型，稱為CpG島甲基化表型(CIMP)，是指出現(xiàn)多基因的甲基化，目前認(rèn)為是腫瘤新的預(yù)后標(biāo)志[3，4]。胃黏膜幽門(mén)螺桿菌感染(H.pylori，HP)是胃癌的高風(fēng)險(xiǎn)因素，一些研究表明，幽門(mén)螺桿菌感染與基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5，6]。我們重點(diǎn)關(guān)注了幽門(mén)螺桿菌感染與CpG島甲基化表型(CIMP)在胃癌中的關(guān)系，分析了75例胃癌患者血清中相關(guān)基因CIMP狀態(tài)(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK和E-cad)和幽門(mén)螺桿菌感染在胃癌預(yù)后中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2008～2010年期間南通市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的經(jīng)病理明確診斷的胃癌和相應(yīng)的非癌臨近組織以及配對(duì)的血清樣本75例，男性53例，女性22例，年齡31～76歲，平均年齡52.35±7.62歲。2周內(nèi)未行抗腫瘤治療采集血樣。健康體檢者40例血清作為對(duì)照，男性18例，女性22例，2組人員均晨起空腹抽取外周靜脈血。組織標(biāo)本離體10min內(nèi)取材，液氮速凍5 min后放置-70℃保存。血清標(biāo)本，3 000×g離心5～10 min，取上層血清，-80℃低溫冰箱凍存或立即抽提取DNA。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑：PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自上海生工)，MSP mix(TaKaRa熱啟動(dòng)酶系統(tǒng))，離心柱型臨床組織基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自上海閃晶生物公司)，離心柱型臨床血液基因組DNA提取試劑盒(上海閃晶生物公司)；瓊脂糖(Amresco公司)，EZ DNA Methylation-Gold KitTM(美國(guó)ZYMO RESEARCH公司)。

1.2.2 主要儀器：德國(guó)Biometra溫度梯度PCR擴(kuò)增儀，ECPS3000/150電泳儀，BECKMAN AllegraTMRA 64R高速低溫離心機(jī)，美國(guó)BIO-RAD公司凝膠圖像分析儀，博日MiniRun凝膠電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 血漿DNA提?。喊瓷虾ｉW晶生物公司臨床標(biāo)本基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作提取血漿DNA。收集到管內(nèi)的核酸溶液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA含量，要求吸光度A260nm/A280nm≥1.8，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank設(shè)計(jì)相關(guān)引物甲基化引物，由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 7種基因甲基化引物

注：M.甲基化；U.未甲基化；F.前導(dǎo)鏈；R.后續(xù)鏈。

1.3.3 DNA甲基化處理：DNA甲基化處理采用美國(guó)ZYMO RESEARCH公司的EZ DNA Methylation-Gold KitTM試劑盒。嚴(yán)格按照說(shuō)明操作。

1.3.4 幽門(mén)螺桿菌感染檢測(cè)：幽門(mén)螺桿菌感染由血清幽門(mén)螺桿菌免疫球蛋白G抗體試驗(yàn)(PBM，普林斯頓，美國(guó))和快速尿素酶試驗(yàn)(福建三強(qiáng)生物化工有限公司，三明，中國(guó))檢測(cè)。血清幽門(mén)螺桿菌免疫球蛋白G抗體試驗(yàn)和快速尿素酶試驗(yàn)的敏感度≥90%的幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)檢測(cè)[7]。

1.3.5 所有病例術(shù)后進(jìn)行了兩年隨訪，最后一次隨訪是在2010年9月12日。患者術(shù)前未接受化療。中位隨訪期是17.5個(gè)月(范圍：8～28個(gè)月)。患者均給予體格檢查、腹部超聲、胸部X射線檢查，收集血清，并進(jìn)行相關(guān)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。在第一年，對(duì)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，每3個(gè)月用CT/或MRI成像進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在75例患者中，13例(17.33%)死于腫瘤相關(guān)的原因。17例(22.67%)出現(xiàn)胃癌復(fù)發(fā)，14例(18.67%)出現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移。62例患者在最后一次隨訪時(shí)仍存活。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本資料采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床相關(guān)資料 腫瘤大小平均為3.8 cm(范圍2.5～9.6 cm)。據(jù)Edmondson-Steiner分期，分類為Ⅰ期6例，Ⅱ期22例，Ⅲ期40例，Ⅳ期7例。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)(格林，佛羅里達(dá)州等，2002年)第6版TNM分期，Ⅰ期24例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例。

分析了75例腫瘤病人以及健康對(duì)照組相關(guān)標(biāo)本7種基因APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad啟動(dòng)子甲基化狀況。結(jié)果顯示：對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因啟動(dòng)子的甲基化改變，75例病人中有69例出現(xiàn)一個(gè)甚至多個(gè)基因的甲基化改變，胃癌組織和相關(guān)血液中相關(guān)基因甲基化頻率均超過(guò)15%，其中APC在胃癌組織為48%，在血清為30.67%；WIF-1在胃癌組織為57.33%，在血清為34.67%；RUNX-3在胃癌組織為56%，在血清為37.33%；DLC-1在胃癌組織為50.67%，在血清為29.33%；SFRP-1在胃癌組織為52%，在血清為33.33%；DKK-3在胃癌組織為54.67%，在血清為32%；E-cad在胃癌組織為48%，在血清為26.67%。按照相關(guān)研究標(biāo)準(zhǔn)[8]，75例相關(guān)胃癌樣本被分為CIMP+(≥3甲基化基因)或CIMP-(兩個(gè)或更少的甲基化基因)。在本研究中，由于臨界值為3，腫瘤組織中的甲基化基因數(shù)平均為3.6，而血清中的甲基化基因數(shù)為2。腫瘤組織樣本中，47例(62.67%)樣本被劃分為CIMP+，28例(37.33%)被劃分為CIMP—。血清樣本中，44例(58.67%)被劃分為CIMP+，31例(41.33%)被劃分為CIMP-。非腫瘤組織和健康對(duì)照組血清均為CIMP-。

2.2 胃癌中幽門(mén)螺桿菌感染及相關(guān)資料 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)75例胃癌樣本中有51例(68%)幽門(mén)螺桿菌感染陽(yáng)性，24例(32%)未感染。在51例幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性胃癌組織中，發(fā)現(xiàn)36例CIMP+和15例CIMP-。而24例未感染胃癌組織中11例CIMP+，13例CIMP-。幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性組和陰性組CIMP表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(χ2= 4.27，P<0.05)，51例幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性血清樣本中，34例CIMP+和17例CIMP-；24例未感染血清樣本中，10例CIMP+，14例CIMP-。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(χ2= 4.21，P<0.05)。

2.3 CIMP在幽門(mén)螺桿菌感染的胃癌預(yù)后中價(jià)值 經(jīng)過(guò)兩年隨訪，有3例HP+/CIMP+病人失訪；31例HP+/CIMP+病人中，有9例出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，10例出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，7例死亡；17例HP+/CIMP-病人中，有2例發(fā)生了轉(zhuǎn)移，3例出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，2例死亡；發(fā)現(xiàn)HP+/CIMP+和HP+/CIMP-兩組轉(zhuǎn)移率明顯不同，HP+/CIMP+病人有轉(zhuǎn)移傾向(χ2=3.593，P<0.05)；HP+/CIMP+組復(fù)發(fā)率明顯高于HP+/CIMP-組(χ2=2.369，P<0.05)；生存率二者未見(jiàn)明顯不同(χ2=1.043，P>0.05)。

3 討論

近年來(lái)，表觀遺傳改變已被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要早期事件[9]。富含CpG島的DNA啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是表觀遺傳沉默的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。異?；虮磉_(dá)可能是腫瘤的早期事件，是腫瘤早期發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物[10]。研究證實(shí)基因的異常甲基化可作為肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的篩選指標(biāo)，基因的甲基化與預(yù)后明顯相關(guān)[11]。也有研究認(rèn)為基因甲基化檢測(cè)在胃癌早期診斷中的價(jià)值很高，特異度高，是一種有效的診斷方式，在患者的臨床診斷方面擁有廣闊的治療前景[12]。

研究發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌感染的胃黏膜活檢標(biāo)本中DNA異常甲基化是胃癌高發(fā)的危險(xiǎn)因素[13]，血液中白細(xì)胞的重復(fù)元件低甲基化與惡性胃黏膜病變以及胃癌進(jìn)展相聯(lián)系[13]。近年來(lái)，術(shù)語(yǔ)“CIMP”已被用于各種胃癌表觀研究中。近年來(lái)幽門(mén)螺桿菌感染與多基因甲基化的關(guān)系已有了一些探討，但很少有人關(guān)注CIMP與幽門(mén)螺桿菌與胃癌的關(guān)聯(lián)或血清中CIMP與胃癌中幽門(mén)螺桿菌之間存在的關(guān)聯(lián)。本研究中我們收集了胃癌病人的組織和血清以及健康對(duì)照的相關(guān)組織和血清并進(jìn)行了7個(gè)腫瘤相關(guān)基因(APC，WIF-1，RUNX-3，DLC-1，SFRP-1，DKK-3和E-cad)CIMP狀態(tài)的檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因啟動(dòng)子的甲基化改變，胃癌組織和血清中相關(guān)基因甲基化頻率均超過(guò)15%，也許多基因甲基化狀態(tài)改變可能對(duì)胃癌的早期診斷具有一定幫助。我們還發(fā)現(xiàn)血清中DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)腫瘤相關(guān)基因是高度特異的，并且與腫瘤組織結(jié)果是相似的。我們檢測(cè)了75例胃癌樣本中的CIMP狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)組織與血清具有很好的一致性。

75例胃癌樣本中有51例(68%)幽門(mén)螺桿菌感染陽(yáng)性，24例(32%)未感染。胃癌中幽門(mén)螺桿菌是很普遍的，這表明預(yù)防和治療胃癌根除幽門(mén)螺桿菌感染可能是必要的。CIMP狀況在腫瘤預(yù)后中的價(jià)值已在多種腫瘤中進(jìn)行了論證，食管腺癌中，CIMP與預(yù)后不良相關(guān)[15]。幽門(mén)螺桿菌也是胃癌預(yù)后的一個(gè)因素，我們研究發(fā)現(xiàn)CIMP與幽門(mén)螺桿菌之間存在關(guān)聯(lián)。幽門(mén)螺桿菌還可引起宿主DNA損傷并改變DNA甲基化干擾下游信號(hào)[16]。

經(jīng)過(guò)兩年隨訪，發(fā)現(xiàn)HP+/CIMP+和HP+/CIMP-兩組轉(zhuǎn)移率明顯不同，HP+/CIMP+病人有轉(zhuǎn)移傾向(P<0.05)；復(fù)發(fā)率HP+/CIMP+組明顯高于HP+/CIMP-組(P<0.05)；生存率二者未見(jiàn)明顯不同(P>0.05)。因此，異常的DNA甲基化可能與慢性炎癥有關(guān)。多重的調(diào)控暗示DNA甲基化是在宿主對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染的反應(yīng)中扮演了一個(gè)重要角色。幽門(mén)螺桿菌通過(guò)降低DNA修復(fù)基因的表達(dá)促進(jìn)遺傳不穩(wěn)定性[17]。經(jīng)過(guò)兩年隨訪后，我們發(fā)現(xiàn)HP+/CIMP+與胃癌病人的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，與生存關(guān)系不大。提示HP+/CIMP+參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與生存無(wú)關(guān)也許是因?yàn)殡S訪時(shí)間太短，結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清DNA啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是具有很高的特異性的，并且與組織具有很好的一致性。因此血清中CIMP檢測(cè)具有和組織中相似的結(jié)果，可以很好解決標(biāo)本來(lái)源受限的相關(guān)病人的檢測(cè)，并為預(yù)后的研究提供便利，解決臨床實(shí)際標(biāo)本困難。因而血清中CIMP檢測(cè)是一個(gè)穩(wěn)定的有用的胃癌預(yù)后監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究由于研究病例相對(duì)較少，腫瘤相關(guān)基因也少，因而相關(guān)結(jié)果有待大樣本證實(shí)。由于隨訪時(shí)間較短，僅僅兩年，可能相關(guān)結(jié)論有些偏差，需要大樣本長(zhǎng)期隨訪進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] Hohenberger P，Gretschel S．Gastric cancer[J]．Lancet．2003，362(9380)：305-315．

[2] An C，Choi IS，Yao JC，et al．Prognostic significance of CpG island methylator phenotype and microsatellite instability in gastric carcinoma[J]．Clin Cancer Res，2005，11(2)：656-663．

[3] Toyota M，Ahuja N，Suzuki H，et al．Aberrant methylation in gastric cancer associated with the CpG island methylator phenotype[J]．Cancer Res，1999，59(21)：5438-5442．

[4] Wang YC，Yu ZH，Liu C，et al．Detection of RA-SSF1A promoter hypermethylation in serum from gastric and colorectal adenocarcinoma patients[J]．World J Gastroenterol，2008，14(19)：3074-3080．

[5] Shin CM，Kim N，Jung Y，et al．Role ofHelicobacterpyloriinfection in aberrant DNA methylation along multistep gastric carcinogenesis[J]．Cancer Sci，2010，101(6)：1337-1346．

[6] Nakajima T，Yamashita S，Maekita T，et al．The presence of a methylation fingerprint ofHelicobacterpyloriinfection in human gastric mucosae[J]．Int J Cancer，2009，124(4)：905-910．

[7] Maekita T，Nakazawa K，Mihara M，et al．High levels of aberrant DNA methylation inHelicobacterpyloriinfected gastric mucosae and its possible association with gastric cancer risk[J]．Clin Cancer Res，2006，12(3pt1)：989-995．

[8] Weisenberger DJ，Siegmund KD，Campan M，et al．CpG island methylator phenotype underlies sporadic microsatellite instability and is tightly associated with BRAF mutation in colorectal cancer[J]．Nat Genet，2006，38(7)：787-793．

[9] Feinberg AP，Ohlsson R，Henikoff S．The epigenetic progenitor origin of human cancer[J]．Nat Rev Genet，2006，7(1)：21-33．

[10] Zhou X，Popescu NC，Klein G，et al．The interferon-alpha responsive gene TMEM7 suppresses cell proliferation and is downregulated in human hepatocellular carcinoma[J]．Cancer Genet Cytogenet，2007，177(1)：6-15．

[11] 陸海一，林 蘭，劉繼斌．拮抗Wnt信號(hào)通路的CpG島甲基化表型在肝癌預(yù)后中的臨床價(jià)值[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(6)：22-25．

Lu HY，Lin L，Liu JB．Clinical significance of CpG island methylator phenotype(CIMP)in plasma associated with prognosis in hepatocellular carcinoma[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2013，28(6)：22-25．

[12] 李 穎，易 默，何小勤．Reprimo和hMLH1基因甲基化在胃癌早期診斷價(jià)值的研究[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015,30(3)：53-55,59．

Li Y，Yi M，He XQ．Research on reprimo，hMLH1 gene methylation in early diagnosis value of gastric cancer[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2015,30(3)：53-55,59．

[13] Niwa T，Tsukamoto T，Toyoda T，et al．Inflammatory processes triggered byHelicobacterpyloriinfection cause aberrant DNA methylation in gastric epithelial cells[J]．Cancer Res，2010，70(4)：1430-1440．

[14] Chen D，Zhang XR，Zhang Y，et，al．Hypomethylation of repetitive elements in blood leukocyte DNA and risk of gastric lesions in a Chinese population[J]．Cancer Epidemiol，2016(41)：122-128．

[15] Eads CA，Lord RV，Wickramasinghe K，et al．Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma[J]．Cancer Res，2001，61(8)：3410-3418．

[16] Servetas SL，Bridge DR，Merrell DS．Molecular me-chanisms of gastric cancer initiation and progression byHelicobacterpylori[J]．Curr Opin Infect Dis，2016，29(3)：304-310．

[17] Sepulveda AR，Yao Y，Yan W，et al．CpG methylation and reduced expression of O6-methylguanine DNA methyltransferase is associated withHelicobacterpyloriinfection[J]．Gastroenterology，2010，138(5)：1836-1844．