呼吸道合胞病毒基因分型的研究進展*

梁有才，陸學東(.廣東醫(yī)學院，廣東湛江 54000；.廣東醫(yī)學院附屬福田醫(yī)院，廣東深圳 58033)

人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus，RSV)是引起嬰幼兒嚴重呼吸道感染的主要病原體之一[1]。RSV的流行受地理位置、季節(jié)、氣候因素影響；在溫帶地區(qū)，無論南北半球，以冬春季節(jié)流行為主；靠近赤道地區(qū)常年流行[2]。RSV感染者一般是兩歲以內(nèi)的嬰幼兒，或者是老年人與免疫缺陷者；隨著兒童年齡增長，感染概率降低。RSV所導致的癥狀包括呼吸道感染、發(fā)燒、中耳炎、哮喘、嚴重的細支氣管炎和肺炎等[3～6]。世界衛(wèi)生組織在全球疫苗計劃中優(yōu)先發(fā)展RSV疫苗，RSV融合蛋白是國外僅有的被批準用于預防高危嬰幼兒感染RSV的單克隆抗體，但在中國尚未被批準使用，中國還沒有預防RSV感染的有效疫苗[4]。

因此，研究準備更多RSV基因與疾病關系的資料，將在RSV感染的疫苗研制、診治和衛(wèi)生保健方面發(fā)揮重要作用。本文擬對RSV的基因分型，及其與疾病的相關性做討論。

1 RSV的基因結構

呼吸道合胞病毒是一種有包膜的RNA病毒，屬于副黏病毒科，肺炎病毒屬，基因有15 222個核苷酸(nt)，共含有10個基因，其側翼序列有44nt的前導序列(leader)與155nt的拖尾區(qū)(trail)，順序為：3’-Leader-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-Trailer-5’，在L基因起始與M2基因結尾序列之間有68nt的重疊基因。除L基因外的其它基因都有保守的起始序列，這些基因包含有病毒復制轉錄的啟動子，L基因的起始序列為3’-CCCCGUUUA……5’，它包含了能讓病毒直接轉錄所需的啟動信息。10個基因能編碼至少11種已知蛋白：NS1和NS2為非結構蛋白，是干擾素系統(tǒng)的拮抗物；N是核殼蛋白；P是磷酸蛋白，是聚合酶復合物的重要成分；M是基質(zhì)蛋白；SH是一種小疏水橫跨膜表面糖蛋白；G是一種N端和O端糖基化的Ⅱ型橫跨膜黏附糖蛋白；F是N端糖基化的Ⅰ型橫跨膜糖蛋白，與細胞質(zhì)膜融合，在物質(zhì)通過胞膜時產(chǎn)生作用；M2基因至少編碼了兩種產(chǎn)物(其中的M2-1是一種獨特的轉錄因子，而M2-2是一種調(diào)節(jié)因子)；L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶的催化亞基。除了NS1，NS2和M2-2以外，所有的蛋白都是病毒顆粒的結構成分。G和F蛋白是主要的保護與中和抗原。N，F(xiàn)，M2-1和SH蛋白是細胞毒性T細胞的靶位[1]。

2 RSV的基因分型

目前RSV基因檢測相關技術有：各種PCR技術，包括巢式PCR，RT-PCR，實時熒光定量PCR等；還包括DNA測序、核酸雜交技術、基因芯片技術、多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)(GeXP)等。分子生物學技術的發(fā)展使RSV基因檢測分型更加快捷準確，越來越多新的RSV基因型被發(fā)現(xiàn)與研究。

已經(jīng)報道的RSV基因型包括RSV-A與RSV-B。RSV-A包括：SAA1，GA1，GA2… GA6，GA7，NA1，NA2，ON1，CB-A。RSV-B包括：URU1，URU2，GB1，GB2，GB3，GB4，SAB1，SAB2，SAB3，SAB4，BA1，BA 2… BA11，BA12，AB4，CB-B，GB5(CB1)[1，3～5，7～9]。

RSV的兩種主要的基因型A(RSV-A)和B(RSV-B)，分型依據(jù)為RSV的G蛋白與單克隆抗體反應的不同，以及G蛋白基因的不同(也有報道，RSV基因分型是基于單克隆抗體對G蛋白、F蛋白的反應，以及這兩種蛋白的基因分析[8]，更細的基因分型基于G蛋白基因C末端結尾第二高度可變區(qū)核苷酸序列分析[3，9]。G蛋白總體構架類似于黏蛋白，但缺少了其它副黏病毒黏附蛋白中所具有的血細胞凝集素和神經(jīng)氨酸酶的活性[1]。G蛋白極易發(fā)生基因突變，典型的RSV-A和RSV-B之間，G蛋白氨基酸序列的50%可以改變，不同基因型間G蛋白氨基酸的同源性可僅有53%，抗原相關性可僅為5%[10]。

RSV-A和RSV-B各自的型內(nèi)也存在主要源于G蛋白的抗原與基因的較大差異(可存在20%的氨基酸改變)，還有SH和N蛋白的有限變異。氨基酸序列的變異處于G蛋白的兩個胞外區(qū)，橫跨膜區(qū)與胞內(nèi)中心富含半胱氨酸區(qū)則高度保守，但位于保守區(qū)旁邊的兩個區(qū)域是高度可變區(qū)。分析這兩個區(qū)域的變化提示有三個突變的機制：①替換；②三個可讀框移碼突變；③終止密碼子的改變，導致不同長度的蛋白的產(chǎn)生[1]?；蛐蛢?nèi)差異為進行更細基因分型提供了依據(jù)，也提供了型內(nèi)進化的基礎。對RSV毒株進行種系遺傳學分析顯示，RSV-A基因進化率估計在6.72×10-4替代/位點/年(95%HPD：5.61×10-4，7.6×10-4)，而RSV-B的進化率估計在7.69×10-4替代/位點/年(95%HPD：6.81×10-4，8.62×10-4)[5]。

此外，有學者提出，不僅僅RSV的基因編碼序列可以變異，控制基因表達的信號也可以改變，所以調(diào)整關鍵蛋白的表達進而影響基因表達是導致抗原變異的第二個原因[1]。推測這可能已經(jīng)影響到了之前的基因分型結果，或可能會成為基因分型的又一個依據(jù)。

3 RSV-A與RSV-B的感染優(yōu)勢對比

RSV的兩種主要基因型RSV-A和RSV-B以各種混合形式傳播[4]，它的流行受地理位置和季節(jié)因素的影響，兩種主要基因型的交替流行可能跟人體免疫導致的選擇壓力有關[2，10]。

很多研究對比了RSV兩種主要基因型的疾病感染優(yōu)勢：De-Pairs等[6]發(fā)現(xiàn)，南巴西的RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。Bose等[5]發(fā)現(xiàn)，烏拉圭蒙得維的亞地區(qū)通常RSV-A占疾病感染優(yōu)勢，但某些感染中，RSV-B會更頻繁地被檢測到。Obodai等[11]發(fā)現(xiàn)，加納的RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。Biswas等[8]發(fā)現(xiàn)，東北印度阿薩姆邦地區(qū)2009～2012年間只檢測到RSV-A(NA1，GA5)感染，未能檢測到RSV-B。Choudhary等[4]總結發(fā)現(xiàn)，西印度2009～2012年RSV-B總體上占疾病感染優(yōu)勢。但2009～2010年期間RSV-B占疾病感染優(yōu)勢，2011年RSV-A占疾病感染優(yōu)勢，在2012年RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。Geis等[12]發(fā)現(xiàn)，德國海德爾堡地區(qū)RSV-A占疾病感染優(yōu)勢。杜麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)，中國重慶地區(qū)2008～2009年度RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。Ren等[7]發(fā)現(xiàn)，中國重慶兒童醫(yī)院檢出的RSV-A總體上占疾病感染優(yōu)勢。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在2009年夏季到2010年的春季RSV-B占疾病感染優(yōu)勢；而在2010年夏季到2012年春季RSV-A占疾病感染優(yōu)勢；在2012年夏季到2013年春季，RSV-B占疾病感染優(yōu)勢。

綜上世界各地資料，總體上看起來RSV-A在更多地方占疾病感染的優(yōu)勢地位，但并不是在所有地方都占據(jù)優(yōu)勢，而且同一個地方的不同時間段優(yōu)勢流行的基因型可不同。目前研究資料提示，相對于RSV-B來說，更多地方RSV-A占據(jù)了感染優(yōu)勢，但沒有某一基因型能穩(wěn)定地占據(jù)流行的主導地位。在某一地區(qū)或者某一時間段的疾病感染中，可能出現(xiàn)兩種基因型同時流行的情況，或者其中的某種基因型占優(yōu)勢的情況[10]。

4 RSV各基因型與呼吸道疾病的嚴重性

RSV的G和F蛋白是病毒中和反應，抗原性和毒力的主要抗原。G蛋白是RSV感染后人體免疫反應的主要靶位(包括F糖蛋白)。G蛋白抗原和基因變異比F蛋白更加頻繁，如此高的變異可能導致G蛋白在促進RSV感染的過程發(fā)揮重要作用[13]。

RSV亞型的改變與RSV的反復感染有關。G蛋白相關免疫是基于其對應亞型的特征產(chǎn)生的，不同亞型的G蛋白，不能誘導機體產(chǎn)生不同亞型間交叉保護作用的有效抗體，毒株之間的基因變異可以改變其致病性和逃避免疫防御而復發(fā)感染和暴發(fā)流行[1，6，10]。

G蛋白胞外區(qū)經(jīng)歷了強烈的陽性選擇，RSV-A的G蛋白就有29個陽性氨基酸選擇位點，比如在GA2與GA3的G蛋白氨基酸序列對比中發(fā)現(xiàn)了一些陽性選擇位點(Pro226Leu，Ser269Thr，Pro289Ser和Pro290Leu)。其中的Pro226Leu是用來辨別GA3的位點，而某些位點(226和290)是RSV-A的抗原表位。在嚴重疾病比如細支氣管炎中，氨基酸這些位點的變化可能發(fā)揮了重要作用[13]。

很多研究發(fā)現(xiàn)，RSV不同基因亞型導致的疾病嚴重程度不同：Goto-sugai等[13]認為，某些RSV基因型和疾病嚴重性的關系存在輕微不同。Goto-sugai等[13]對G蛋白的基因分析時發(fā)現(xiàn)，GA3與很嚴重的疾病相關，例如細支氣管炎、肺炎。有報道認為[14]，相對于B7和B9，NA1與嚴重的住院病情更緊密相關。Panayiotou等[3]指出，先前有報道認為RSV-A導致疾病的嚴重性大于RSV-B，而他們的研究提示RSV-BA(屬于RSV-B)導致疾病的嚴重性大于RSV-A。他們還發(fā)現(xiàn)，相對于GA2與BA基因亞型，ON1亞型所致疾病較輕。另外，與其它人不同，Goto-sugai等[13]發(fā)現(xiàn)，GA2和BA與細支氣管炎相關，而RSV-A所引起疾病的嚴重性與RSV-B所引起疾病的嚴重性沒有明顯不同。

綜上所述，G蛋白的高度變異在RSV病毒感染與復發(fā)感染中發(fā)揮了重要作用。G蛋白的基因改變是RSV分型的基礎，因此它的變異也是RSV不同亞型導致疾病輕重不同的關鍵。目前對RSV基因型與疾病的相關性研究，已經(jīng)從討論RSV-A及RSV-B向討論更細的基因亞型過渡，比如BA，ON1，GA2，GA3，GA5等。RSV-A與RSV-B兩者都有可能導致相對嚴重的臨床癥狀，就本文所知，總體上RSV-A比RSV-B導致了更多的嚴重疾病，但其相關性尚未完全明確。RSV-A與RSV-B究竟哪一種更能導致更嚴重的疾病，尚未定論，有待后續(xù)更多系統(tǒng)性研究來證實。另外，有報道認為，相對基因型來說，呼吸道所感染的病毒量跟疾病輕重相關性更為明顯[3，13]。

5 展望

我們知道，RSV的基因分型與疾病嚴重性的關鍵，主要源于G蛋白的基因和抗原的改變。但RSV各基因型與疾病的相關性尚未完全明了。RSV各基因型的流行病學資料還不夠齊全，系統(tǒng)闡述尚需進一步的調(diào)查研究。

今后應從以下幾個方面努力：①系統(tǒng)地、有計劃地在世界各地進行RSV基因檢測及分型，統(tǒng)計好各地RSV各基因型流行病學資料，建立其全世界范圍的RSV基因型流行病學資料庫。②系統(tǒng)地研究RSV各基因型與所致疾病的關系，統(tǒng)計其與疾病輕重及臨床癥狀的相關性，建立針對特定基因型的預防診療方案。③尋找藥物可以有效作用的RSV基因靶位及其表達抗原，尋找可用于疫苗研制的基因序列。④重視分子診斷技術與醫(yī)學交叉結合的學科，開發(fā)更先進適用的分子生物學分析技術并應用于臨床診斷治療。

總之，新的分子生物學技術的發(fā)展給RSV基因及其分型的研究帶來了極大便利和機遇。繼續(xù)推進RSV基因及其分型的研究，會推動RSV疫苗研制和感染風險模型的建立，會給RSV感染的預防、診治、衛(wèi)生保健等帶來重大幫助。

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