miR-205在ITP患者外周血單個核細(xì)胞中的表達(dá)及意義*

鄧順江，黃韋華，吳林洪，張 蕾，葉 辛，劉 鵬，李騰達(dá)，龍曙萍，錢 琤，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院，上海 200003；4.解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州 215007)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)被認(rèn)為是一種由自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增加以及生成減少引起的疾病，臨床上以血小板計數(shù)減少和皮膚黏膜出血為特點[1]。但研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為ITP的發(fā)病是一個多步驟的過程，各種免疫細(xì)胞包括T,B細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞以及相關(guān)的細(xì)胞因子在ITP的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2～6]。

Micro-RNA(miRNA)是一種長度大約為22個核苷酸的微小非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[7]，因而參與體內(nèi)多種生理病理過程。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，最近有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在ITP的發(fā)病中也發(fā)揮了重要的作用[8～10]。例如，miR-155在ITP患者的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中表達(dá)上調(diào)，而在治療后表達(dá)下調(diào)[11]；miR-302c-3p，miR-483-5p等miRNA在ITP兒童患者的血漿中表達(dá)水平升高。然而，ITP患者中具體有哪些miRNA表達(dá)異常目前還有待進(jìn)一步研究，miRNA在ITP的發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制至今還未闡明。

我們前期通過基因芯片的實驗發(fā)現(xiàn)miR-205在ITP患者中表達(dá)明顯上調(diào)，此次研究通過實時定量PCR的方法檢測患者PBMC中miR-205的表達(dá)水平，并分析其與患者血小板計數(shù)之間的相關(guān)性，為后續(xù)研究提供新線索。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 選取長海醫(yī)院2014～2015年收治的ITP患者外周抗凝全血43例，其中男性21例，女性22例，年齡為22～63歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合“成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診治的中國專家共識(修訂版)”[12]，且均未接受過相關(guān)治療。同時選取體檢中心健康對照組38例，其中男性20例，女性18例，年齡為20～62歲，每例標(biāo)本大約2 ml。ITP組和健康對照組在年齡和性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑盒(購自takara公司)；Trizo試劑(Invitrogen life technologies)；淋巴細(xì)胞分離液，氯仿(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇，異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DEPC水，dd水，紅細(xì)胞裂解液，2 ml EP管，200 μl EP管，Centrifuge 5417 R低溫高速離心機(jī)，純水儀，紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)，梯度PCR儀(ABI)，PCR儀(ABI7500)。

1.3 檢測方法 外周血PBMC的分離和總RNA的提?。河昧馨图?xì)胞分離液從EDTA-K2抗凝的2 ml靜脈中分離PBMC，用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(ND-1000，Nanodrop Technologies)檢測所提取RNA的濃度及純度。

CDNA的合成以及Real-timePCR反應(yīng)miR-205以及U6的特異引物由上海賽百勝公司設(shè)計和合成，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用定量PCR試劑盒進(jìn)行核酸擴(kuò)增，試劑盒購自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄和PCR條件嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 ITP患者分組標(biāo)準(zhǔn) 選取的未經(jīng)治療的ITP患者歸為初診組(naive ITP group)，ITP患者的治療符合國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[12]，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)治療后：血小板>100×109/L且病情穩(wěn)定的患者歸完全緩解組(Complete remission group，CR group)，共14例；血小板<100×109/L的患者或治療有效但復(fù)發(fā)的患者歸不完全緩解組(incmplete remission group，IR group)，共29例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism6進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間均值比較采用獨立樣本t檢驗(Studentttests)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)miR-205的表達(dá) 與38例正常對照組相比，43例ITP初診患者(Naive ITP)PBMC miR-205的表達(dá)水平更高(1.81±0.48 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.31，P<0.01)；治療后不完全緩解組(IR group)和初診患者相比，miR-205的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.112)，與正常對照組相比，則表達(dá)升高(1.63±0.65 vs 0.92±0.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.2，P<0.01)；14例治療后完全緩解組(CR group)治療后(After treatment)PBMC miR-205的表達(dá)低于治療前(Before treatment)的表達(dá)水平(1.07±0.43 vs 1.91±0.34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.68，P<0.01)。

2.2 相關(guān)性分析 ITP患者PBMC miR-205與血小板計數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ITP患者PBMC miR-205與血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.069 6，P<0.05)，見圖1。

3 討論

MicroRNA是一種微小(19～23個核苷酸)的單鏈非編碼RNA，通過結(jié)合mRNA的3’非翻譯序列區(qū)(3’untranslated sequence region，3’-UTR)而使mRNA降解或者抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，一個microRNA可能結(jié)合多個mRNA，一個mRNA也可能被多個microRNA所調(diào)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)microRNA在多種疾病狀態(tài)下存在異常的表達(dá)，提示其參與了人體的發(fā)病過程。miR-205的編碼基因LOC642587定位于染色體1q32.2區(qū)，miR-205的前體位于LOC642587的第二個內(nèi)含子和第三個外顯子鏈接的區(qū)域，是一個高度保守的microRNA，在多種疾病中都表現(xiàn)出異常的表達(dá)，比如Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-205通過調(diào)節(jié)其靶基因SMAD2而抑制了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，miR-205的表達(dá)低于癌旁組織。有研究[15，16]發(fā)現(xiàn)miR-205抑制其靶基因MLL-AF4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，而MLL-AF4是一種可以引起急性白血病的致癌基因，miR-205高表達(dá)的最終結(jié)果是抑制細(xì)胞的增殖，這給急性白血病的治療找到了新的突破口。Hu等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-205通過抑制其靶基因VEGFA和FGF2從而增加了乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度。

圖1 原發(fā)性血小板減少癥(ITP)患者PBMC miR-205表達(dá)水平與血小板計數(shù)結(jié)果的相關(guān)性

ITP是臨床上常見的由血小板減少和破壞增多而引起的自身免疫性血液系統(tǒng)疾病。血小板的數(shù)量在一定程度上反映了TIP的嚴(yán)重程度，患者血小板計數(shù)結(jié)果越低，表明患者病情越重，反之則病情相對較輕。本次研究通過實時熒光定量PCR的方法，發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC中miR-205表達(dá)顯著高于健康對照組，并且miR-205的表達(dá)水平與患者外周血血小板計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，這提示miR-205可能參與了ITP的發(fā)病，并且可能與ITP 的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，癥狀越嚴(yán)重的患者，其miR-205的表達(dá)水平也越高。另外我們對43例ITP初診患者進(jìn)行了跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29例未完全緩解組miR-205的表達(dá)水平和初診時相比基本未改變，而14例完全緩解組治療后miR-205的表達(dá)水平與治療前相比，顯著降低，這也提示了miR-205與ITP的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。但miR-205是如何影響血小板的數(shù)量的，是作用于哪個靶基因以及通過什么信號通路而參與到ITP的發(fā)病與預(yù)后還有待進(jìn)一步探索。

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