湖北地區(qū)禽源性空腸彎曲菌的分離鑒定及耐藥性分析

董俊+韓梅+邵華斌+羅青平+劉國平+張騰飛

摘要：為了解湖北省禽源空腸彎曲菌的流行病學(xué)及耐藥性情況，從武漢市及其周邊地區(qū)采取禽源樣品276份，其中肛拭子175份，盲腸內(nèi)容物101份。共分離出50株空腸彎曲菌，分離率為18.12%，其中肛拭子分離20株，盲腸內(nèi)容物分離30株。結(jié)果顯示，不同采樣途徑空腸彎曲菌的分離率不同，盲腸內(nèi)容物分離率高于肛拭子。采用定性測定紙片擴(kuò)散法對以上分離的菌株進(jìn)行藥敏試驗，50株空腸彎曲菌分離株對氨基糖苷類藥物敏感性最高（S≥66.0%），其次分別是紅霉素（S=70.0%）和磺胺甲基異惡唑（S=58.0%）。對喹諾酮類藥物耐藥性最強(qiáng)（R=100%）。

關(guān)鍵詞：彎曲菌;分離鑒定;耐藥性

中圖分類號：S852.61+3 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2015）23-5959-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.042

Isolation，Identification and Antimicrobial Susceptibility Proflles of Campylobacter jejuni Isolates from Poultry in Hubei

DONG Jun1，2，HAN Mei2，SHAO Hua-bin2，LUO Qing-ping2，LIU Guo-ping1，ZHANG Teng-fei2

（1.College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei，China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： To investigate the epidemiological and antimicrobial susceptibility profiles of Campylobacter jejuni in poultry in Hubei province， 276 samples was collected， thereinto 175 were from feces and 101 were from contents of cecum. 50 （18.12%） Campylobacter jejuni was isolated in total， among the isolates， 20 isolates were separated from feces， and 30 isolates were separated from the contents of cecum. The results showed that the separation rate from contents of cecum was higher than that from feces. The disk diffusion test method was used to determine resistance of the isolates. The results showed that the isolates were most sensitive to aminoglycosides（S≥66%），secondly to erythromycin，sulfamethoxazole， and all strains were resistant to floroquinolones （R=100%）.

Key words：Campylobacter jejuni;Isolation and Identification;Drug resistance

彎曲菌（Campylobacter）是自然界中廣泛存在的、全球范圍內(nèi)主要的食源性人獸共患性病原菌之一[1]。對人致病的彎曲菌中 93.4%為空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni），2.3%為結(jié)腸彎曲菌（Campylobacter coli，C. coli），其他彎曲菌偶爾致病[2]。特定血清型空腸彎曲菌引起的腸炎是格林-巴利綜合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）的重要前驅(qū)因子[3-5]。

近年來，許多國家空腸彎曲菌發(fā)病率呈指數(shù)增長趨勢，主要引起急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利綜合征等免疫性損傷性疾病。在獸醫(yī)臨床中，空腸彎曲菌可引起家畜流產(chǎn)、不孕、乳房炎及幼畜腹瀉和家禽肝炎[6-9]?？漳c彎曲菌是野生、家養(yǎng)動物的正常寄居菌，感染的動物通常無明顯病癥，但可長期向外界排菌，通過排泄物或分娩污染食物和飲水，從而引起人類感染。其中，家禽是空腸彎曲菌病最重要的傳染源之一。隨著畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中抗生素藥物的不合理使用，空腸彎曲菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，尤其是對喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物，也給空腸彎曲菌的防控帶來了很大的困難。

了解空腸彎曲菌流行病學(xué)及其耐藥性情況是預(yù)防和控制畜禽以及人類空腸彎曲菌病的重要前提，是保障公共衛(wèi)生及養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要舉措。本研究對湖北省采集的禽源樣品進(jìn)行空腸彎曲菌的分離鑒定，并進(jìn)行了耐藥性分析。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品來源 ?從湖北省不同養(yǎng)殖場及農(nóng)貿(mào)市場采集肛拭子（拭子置于Cary-blair半固體運送培養(yǎng)基中，在采樣后2 h內(nèi)送實驗室培養(yǎng)）及新鮮盲腸樣品，共276份。endprint

1.1.2 ?培養(yǎng)基及試劑 ?炭頭孢哌酮去氧膽酸（mCCDA）培養(yǎng)基、添加劑及厭氧罐購自O(shè)XOID公司，布氏肉湯、Cary-Blair半固體培養(yǎng)基購自北京陸橋生物科技公司，Taq酶、DNA Marker及基因組抽提試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司、微需氧產(chǎn)氣袋購自日本MGC公司;常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 ?藥物 ?藥敏試紙片7大類16種均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

β內(nèi)酰胺類：頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢唑啉;氨基糖苷類：鏈霉素、新霉素、丁胺卡那;四環(huán)素類：四環(huán)素;磺胺類：磺胺甲基異惡唑;喹諾酮類：環(huán)丙沙星、諾氟沙星、環(huán)丙氟哌酸;林可酰胺類：林可霉素;大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)菌分離培養(yǎng)

用接種環(huán)挑取少量盲腸內(nèi)容物接種到mCCDA選擇性培養(yǎng)基上（肛拭子直接劃線接種到mCCDA選擇性培養(yǎng)基上）接菌后的平板置于厭氧罐中，根據(jù)厭氧罐容量2.5 L/袋的標(biāo)準(zhǔn)，放入微需氧產(chǎn)氣袋（5%O2，10%CO2，85%N2），隨后連同容器一并置于42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 ?空腸彎曲菌的分離純化 ?在平板上挑取灰色、透明、針尖狀或水珠狀菌落劃線于mCCDA平板上進(jìn)行純化。

1.2.3 ?菌株的保存 ?將分離得到的菌株，接種于含10%小牛血清的布氏肉湯中微需氧環(huán)境培養(yǎng)48 h，將菌液轉(zhuǎn)入無菌EP管中，加入滅菌甘油使混合液中甘油濃度達(dá)到30%，-70 ℃保存。

1.2.4 ?細(xì)菌的初步鑒定 ?根據(jù)菌落生長特征、革蘭氏染色特征、氧化酶試驗和過氧化氫酶試驗結(jié)果、按照GB/T4789.9-2014進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.5 ?分子生物學(xué)鑒定

1）PCR鑒定引物的確定。參考Linton等[10]設(shè)計的空腸彎曲菌hipO基因引物：HIP400F： 5′-GAA GAG GGT TTG GGT GGT G-3′，HIP1134R： 5′-AGC TAG CTT CGC ATA ATA ACT TG-3′。

2）細(xì)菌總DNA的提取。將菌種接種于5 mL布氏肉湯（加新生牛血清10%），微需氧條件下培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用基因組抽提試劑盒提取菌株的總DNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL， 包括2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）10 μL、DNA模板5 μL（10～100 ng）、上下游引物各1 μL，超純水8 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。配制1%瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物5 μL加樣，電壓130 V，電泳24 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析試驗結(jié)果。

1.2.6 ?藥敏試驗 ?根據(jù)臨床用藥情況和對公共衛(wèi)生的影響，選擇7大類16種抗菌藥物，按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI 2010版）的標(biāo)準(zhǔn)，用定性測定紙片擴(kuò)散法檢測所有菌株對16種抗菌藥物的耐藥情況，參考CLSI標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，符合表2所列標(biāo)準(zhǔn)則判定菌株耐藥。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?分離鑒定結(jié)果

276份樣品分離出50株空腸彎曲菌，分離率18.12%。其中肛拭子分離20株，盲腸內(nèi)容物分離30株，分離率分別為11.43%和29.70%（表1）。結(jié)果顯示，不同采樣途徑空腸彎曲菌的分離率不同，盲腸內(nèi)容物分離率明顯高于肛拭子。

2.2 ?細(xì)菌初步鑒定

分離菌在mCCDA平板上表面長出透明有光澤，較小的圓形光滑，灰色閃金屬光的菌落，該菌落扁平濕潤，呈擴(kuò)散性生長;用接種環(huán)挑有黏性的菌落，染色鏡檢為革蘭陰性，菌體彎曲如小逗點狀，呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。

對50株分離菌株進(jìn)行了生化試驗，結(jié)果均符合空腸彎曲桿菌的生化特征，氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、馬尿酸鹽水解試驗、吲哚乙酸脂水解試驗均為陽性。

2.3 ?PCR鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，該PCR方法對空腸彎曲桿菌能擴(kuò)增出特異性片段，大小為735 bp。

2.4 ?藥敏試驗結(jié)果

50株空腸彎曲菌對氨基糖苷類藥物敏感性最高（S≥66.0%）;其次分別是紅霉素（S=70.0%）和磺胺甲基異惡唑（S=58.0%）;對喹諾酮類藥物耐藥性最強(qiáng)（R=100%）。

3 ?討論

家禽肉制品是日常飲食生活中常見的食物，隨著人民生活水品的提高，家禽肉制品的消費量越來越大。近年來，國內(nèi)外空腸彎曲菌感染人的趨勢率逐年上升，家禽是人感染彎曲菌的主要來源，據(jù)報道，鴨泄殖腔中分離的彎曲菌分離率高達(dá)96.6%。在日本雞源彎曲菌分離率高達(dá)47.2%，禽源空腸彎曲菌對人類衛(wèi)生安全造成了潛在的威脅[11]。

此次調(diào)查湖北地區(qū)禽源空腸彎曲菌的流行性情況，在采集樣品的8個地區(qū)家禽群中呈現(xiàn)陽性，分離率為18.12%，說明空腸彎曲菌已在湖北地區(qū)家禽中普遍存在。另外，不同采樣來源的分離率不同，盲腸內(nèi)容物分離率高于肛拭子?？漳c彎曲菌對周圍環(huán)境敏感且易進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)，空腸彎曲菌的最適合定植在動物腸道37～42 ℃的微需氧環(huán)境，利用腸道的有利環(huán)境進(jìn)行生長繁殖。而泄殖腔靠近外界環(huán)境，營養(yǎng)、溫度和微需氧條件都達(dá)不到最適條件，因此分析泄殖腔內(nèi)的空腸彎曲菌活性程度自然較低，分離率也就較腸黏膜分離率低。endprint

空腸彎曲菌的耐藥性日趨嚴(yán)重的問題已經(jīng)引起了世界各國的重視，但目前還沒有廣泛認(rèn)可的空腸彎曲菌耐藥標(biāo)準(zhǔn)，阻礙了空腸彎曲菌耐藥性的研究[12]。本研究為食源空腸彎曲菌的耐藥性研究提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，空腸彎曲菌分離菌株對氨基糖苷類藥物敏感性最高，其次分別為紅霉素，磺胺甲基異惡唑，對喹諾酮類藥物耐藥性最強(qiáng)。人類可通過食用受到耐藥菌株污染的食物而感染發(fā)病，并且會產(chǎn)生耐藥性，所以應(yīng)該引起高度的重視。空腸彎曲菌對氨基糖苷類藥物敏感性高，對喹諾酮類藥物耐藥性強(qiáng)，這與國外報道的相一致[13，14]。據(jù)Alfredson等報道，空腸彎曲菌對喹諾酮類藥物耐藥性增強(qiáng)，可能因為抗生素藥物的頻繁使用導(dǎo)致C257T gyrA基因的單一突變[15]。這可能與畜禽養(yǎng)殖中使用的飼料添加劑及臨床使用藥物的頻率、強(qiáng)度有關(guān)。從公共衛(wèi)生健康的角度來看，喹諾酮類藥物在食用動物中使用的監(jiān)測應(yīng)該迅速建立起來。

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