響應(yīng)面法優(yōu)化茯苓多糖硫酸酯化合成工藝及其抗凝血活性分析

陳小紅

摘要：以中藥茯苓（Poria cocos）為原料提取茯苓多糖，以氨基磺酸為酯化試劑對(duì)茯苓多糖進(jìn)行硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性，制備硫酸酯化茯苓多糖（SP），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化其制備條件。對(duì)獲得的SP進(jìn)行純化、結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)小白鼠體內(nèi)抗凝血試驗(yàn)考察SP的抗凝血活性。結(jié)果表明，最佳的硫酸酯化工藝條件為反應(yīng)溫度85 ℃、反應(yīng)時(shí)間4.0 h、氨基磺酸∶多糖質(zhì)量比為3.77∶1，在此條件下，硫酸基團(tuán)取代度（DS）為1.041，與氯磺酸吡啶法相比取代度相當(dāng)。精制后SP的紅外圖譜表明，SP具有多糖及硫酸根基團(tuán)的特征吸收峰;紫外光譜掃描表明SP無(wú)核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，純度較高，且有硫酸根基團(tuán)的特征吸收，硫酸酯化成功。茯苓多糖經(jīng)硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性后表現(xiàn)出良好的抗凝血活性，其出血時(shí)間、全凝血時(shí)間、全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率均明顯提高;SP對(duì)凝血酶的抑制作用與其濃度呈正相互作用，隨著SP腹腔注射給藥劑量增大，其全凝血時(shí)間、延長(zhǎng)率均明顯提高。

關(guān)鍵詞：茯苓（Poria cocos）;硫酸酯化;茯苓多糖;響應(yīng)面法;抗凝血活性

中圖分類號(hào)：S567.3+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5995-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.051

Analysis of The Optimization of Sulfation Pachymaran Synthesis Technology Process by Response Surface Method and Sulfation Pachymaran Anticoagulant Activity

CHEN Xiao-hong

（College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：The pachyman was extracted from traditional Chinese medicine Poria cocos，with amino sulfo-nic acid as esterification reagent， treated the pachyman with sulfated processing to make sulfation pachymaran （SP） ?and optimized the conditions of their production processing by response surface method. After purification， structural characterization，sulfation pachymaran（SP） was examined the anticoagulant activity by the anticoagulant effect test in mice. Experimental results showed that the optimal sulfated processing of sulfation pachymaran（SP） were as follows： reaction time 4.0 h，chlorousulfonic acid and pyridine mass ration 3.77∶1，reaction temperature 85 ℃. Under those conditions the degree of substitution was 1.041，the degree of substitution was equal compared with the method of chlorosulfonic acid pyridine in the same conditions. The SP has the characteristics of polysaccharides and sulfate group absorption peak in its ir spectrum after refined， the SP showed high purity and no impurities such as nucleic acids， proteins， and had the characteristics of sulfate group absorption in its UV scanned map. Good anticoagulant activity was showed in the SP， its BT， CT and CT extension rate were significantly improved. The effect on inhibition of thrombin was positively interaction with and SPs concentration， CT and CT extension rate were obviously improved with the do-sage increased by intraperitoneal injection.

Key words： Poria cocos; sulfation; pachymaran（SP）; response surface method; anticoagulant activity

中藥茯苓（Poria cocos）為多孔菌科真菌茯苓的菌核，俗稱云苓、松苓、茯靈，是寄生在松樹(shù)根上的菌類植物，形狀像甘薯，外皮黑褐色，里面白色或粉紅色。其原生物為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，菌核呈球形或不規(guī)則塊狀，大小不一。茯苓味甘、淡，性平，入藥具有利水滲濕、益脾和胃、寧心安神的功用[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，茯苓多糖為中藥茯苓的主要有效成分，但未經(jīng)結(jié)構(gòu)改性的茯苓多糖對(duì)腫瘤抑制率僅0.3%，活性低、水溶性差，難以利用，因此必須對(duì)原茯苓多糖進(jìn)行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)改性以提高其活性[2]。對(duì)茯苓多糖進(jìn)行硫酸酯化改性可得到硫酸酯化茯苓多糖（SP）[3]，硫酸酯化茯苓多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物學(xué)活性[4]。多糖硫酸酯化的方法有Wolfrom法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氨基磺酸法等。其中氨基磺酸法是目前較為優(yōu)越的方法[5]，其硫酸酯化茯苓多糖的取代度可達(dá)到0.95，且避免了使用濃硫酸、氯磺酸、三氧化硫等強(qiáng)酸性物質(zhì)，使反應(yīng)安全性大大提高，能夠顯著地簡(jiǎn)化反應(yīng)工藝，使工業(yè)化生產(chǎn)更環(huán)保。因此，本試驗(yàn)以中藥茯苓為原料通過(guò)稀堿浸提醇沉法獲得茯苓多糖，以氨基磺酸為硫酸酯化試劑制備硫酸酯化茯苓多糖。以硫酸酯化茯苓多糖的取代度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化其制備條件，并對(duì)獲得的硫酸酯化茯苓多糖進(jìn)行純化、結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)小白鼠體內(nèi)抗凝血藥效試驗(yàn)考察其抗凝血活性。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料及儀器

中藥茯苓購(gòu)于龍巖市海華連鎖藥店;氨基磺酸，廣州市銀霖化工有限公司;二甲亞砜（DMSO），上海德茂化工有限公司;氫氧化鈉、無(wú)水乙醇，西隴化工股份有限公司。所用試劑均為A.R.級(jí)。

瓊脂糖凝膠電泳試劑：電極緩沖液（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、染色液（0.01%甲苯胺藍(lán)溶液）、指示劑（0.1%溴酚藍(lán)溶液），脫色劑（醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5.0∶5.0，體積比）[6]。

主要儀器：LDZ5-2型離心機(jī)、BP221S型電子天平、UV-300型紫外光譜儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、島津IR-400型紅外光譜儀。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茯苓多糖的制備 ?將中藥茯苓粉碎，過(guò)80目篩，得茯苓粉原料。取原料20 g，按如下過(guò)程操作：原料→乙酸乙酯除酯類→熱水回流浸提→濃縮得濾液→濾液活性炭脫色→真空旋轉(zhuǎn)濃縮→Sevag除蛋白→3倍量95%乙醇沉淀、靜置過(guò)夜→乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌→低溫干燥→茯苓多糖[7]。

1.2.2 ?SP的制備 ?準(zhǔn)確稱取1 g茯苓多糖，加入50 mL二甲基亞砜溶解于500 mL的平底燒瓶中，室溫下攪拌10 h，于油浴鍋中加熱升至反應(yīng)溫度60～120 ℃后加入適量氨基磺酸，磁力攪拌一定時(shí)間，得到的產(chǎn)物在冰水浴中冷卻至0 ℃，然后用20% NaOH溶液調(diào)pH至7.0左右，加水至總體積為300 mL，把樣品轉(zhuǎn)移至透析袋中，分別用自來(lái)水和蒸餾水透析2～3 d，透析液減壓濃縮至一定體積后用3倍量95%乙醇沉淀，再分別用丙酮、乙醚洗滌，沉淀、干燥，獲得硫酸酯化茯苓多糖（SP）[5]。

1.2.3 ?單因素試驗(yàn)

1）在氨基磺酸/多糖（質(zhì)量比）為3∶1，反應(yīng)溫度80 ℃的條件下考察不同硫酸酯化反應(yīng)時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h）對(duì)SP硫酸基團(tuán)取代度的影響。

2）取反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.5 h的條件下，考察不同氨基磺酸/多糖（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，質(zhì)量比，下同）對(duì)SP硫酸基團(tuán)取代度的影響。

3）取反應(yīng)時(shí)間3.5 h、氨基磺酸/多糖為4∶1，考察不同硫酸酯化反應(yīng)溫度（60、70、80、90、100、110、120 ℃）對(duì)SP硫酸基團(tuán)取代度的影響。

1.2.4 ?響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件 ?以反應(yīng)時(shí)間、氨基磺酸/多糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度3個(gè)因素進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳水平，分別以3個(gè)因素為自變量，硫酸基團(tuán)取代度為響應(yīng)值，對(duì)多糖硫酸酯化條件采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，其因素和水平見(jiàn)表1。

硫酸基團(tuán)取代度（DS）的計(jì)算參照林標(biāo)聲[8]等的方法，公式為：取代度（DS）=■，式中S為硫基百分含量。

1.2.5 ?SP的精制 ?取SP 200 mg注入Sephadex G-100，蒸餾水平衡，上樣，0.1 mo/L NaCl洗脫，分管收集，用苯酚-硫酸法跟蹤測(cè)定洗脫液，合并洗脫的多糖溶液，透析、減壓、濃縮、干燥，得到精制的SP。

1.2.6 ?SP的結(jié)構(gòu)表征 ?紅外光譜分析：以KBr為對(duì)照，取0.5 g KBr分別與5.0 mg茯苓多糖、5.0 mg SP精制品研勻，制成薄片，采用紅外光譜儀對(duì)其進(jìn)行紅外光譜掃描，以茯苓多糖為對(duì)照，分析SP的結(jié)構(gòu)特征。紫外光譜分析：用雙蒸水分別將茯苓多糖、SP精制品配置成1.0 mg/mL的溶液，采用UV-300型紫外光譜儀對(duì)其進(jìn)行光譜掃描，掃描范圍400～190 nm[9]。

1.2.7 ?小白鼠體內(nèi)抗凝血藥效試驗(yàn) ?以生理鹽水為空白，分別準(zhǔn)確稱取0.4 g硫酸酯化茯苓多糖與茯苓多糖，將其超聲分散溶解于40 mL的生理鹽水中，用于小白鼠腹腔注射給藥。取小白鼠于試驗(yàn)室飼養(yǎng)4 d，隨機(jī)分成3組：空白組、Ⅰ組和Ⅱ組，每組取10只，空白組腹腔注射生理鹽水，Ⅰ組腹腔注射茯苓多糖，Ⅱ組腹腔注射硫酸酯化茯苓多糖[10]，以30 mg/kg劑量給藥。1次/6 h為給藥周期，共給藥4次，于第四次給藥2 h后進(jìn)行凝血試驗(yàn)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1）小白鼠全凝血時(shí)間（CT）及全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率的測(cè)定：小白鼠尾靜脈取血0.9 mL，加3.8%檸檬酸三鈉0.1 mL，混合3 000 r/min離心分離15 min，分離血漿。取同一小白鼠0.1 mL血漿3份分別裝入3支試管中，于37 ℃水浴恒溫5 min。之后在3支試管中分別加入0.025 mol/L的氯化鈣溶液0.1 mL，分別記錄3支試管內(nèi)血液開(kāi)始凝固所消耗的時(shí)間，取其平均值，測(cè)定全凝血時(shí)間并計(jì)算全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率[11]：

全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率=

■×100%

2）小白鼠出血時(shí)間（BT）的測(cè)定：腹腔注射給藥20 min后，將小白鼠尾尖5 mm剪去，自尾部血液開(kāi)始流出計(jì)時(shí)，每隔15 s把小白鼠尾部的血用濾紙吸去，直至血液停止流出為止，所耗時(shí)間即為BT。

3）SP給藥劑量對(duì)小白鼠全凝血時(shí)間（CT）及全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率的影響：將SP分別以10、20、30、40、50 mg/kg劑量對(duì)小白鼠腹腔注射給藥，測(cè)定其全凝血時(shí)間并計(jì)算全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?硫酸酯化反應(yīng)單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 ?硫酸酯化反應(yīng)時(shí)間 ?如圖1所示，隨硫酸酯化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SP硫酸基團(tuán)取代度迅速增大，當(dāng)反應(yīng)3.5 h后硫酸基團(tuán)取代度值達(dá)到最大1.02，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間硫酸基團(tuán)取代度值不變，說(shuō)明反應(yīng)3.5 h后茯苓多糖的硫酸酯化反應(yīng)達(dá)到平衡。因此，茯苓多糖的硫酸酯化最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間取3.5 h。endprint

2.1.2 ?氨基磺酸/多糖 ?如圖2所示，氨基磺酸/多糖（質(zhì)量比）為4∶1時(shí)，SP的硫酸基團(tuán)取代度值達(dá)到最大，因此，取氨基磺酸/多糖最適質(zhì)量比為4∶1。

2.1.3 ?硫酸酯化反應(yīng)溫度 ?如圖3所示，硫酸酯化反應(yīng)溫度的升高有利于茯苓多糖的硫酸酯化，主要是由于溫度升高有利于氨基磺酸分解生成SO3，促進(jìn)茯苓多糖的硫酸酯化，反應(yīng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，SP的硫酸基團(tuán)取代度值最大，其值為1.02。反應(yīng)溫度高于90 ℃時(shí)，SP的硫酸基團(tuán)取代度值反而降低，主要可能是高溫破壞了茯苓多糖的結(jié)構(gòu)，引起多糖降解，導(dǎo)致SP的硫酸基團(tuán)取代度值降低。因此，茯苓多糖的硫酸酯化最適反應(yīng)溫度為80 ℃。

2.2 ?響應(yīng)面法優(yōu)化氨基磺酸硫酸酯化多糖條件

按Box-Behnken優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行SP的制備，測(cè)定不同制備條件下獲得的SP的硫酸基團(tuán)取代度值，結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型的F值為4.56，表明該模型是顯著的，模型分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析得到方程：DS=-1.301 75+0.043 525A+0.349 5B-0.090 5C-（1.75E-3）AB+（2.00E-3）AC-（5.00E-3）BC-（2.65E-4）A2-0.024B2-（6.00E-3）C2。方程的R2=0.964 3，說(shuō)明方程的擬合程度較好，通過(guò)方程可以很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，模型的“Prob>F”<0.05、失擬項(xiàng)的P=0.064 8>0.05不顯著，表明模型的可信度高，可以通過(guò)該模型優(yōu)化氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的工藝條件。對(duì)不同的影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖4、5、6所示。

由響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖最優(yōu)工藝∶反應(yīng)溫度為84.75 ℃，氨基磺酸∶茯苓多糖質(zhì)量比為3.77∶1，反應(yīng)時(shí)間為4.0 h，在此條件下SP的取代度DS達(dá)到1.045。

2.3 ?氨基磺酸硫酸酯化多糖優(yōu)化條件的驗(yàn)證

對(duì)優(yōu)化結(jié)果的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，取反應(yīng)溫度為85 ℃，氨基磺酸∶茯苓多糖（質(zhì)量比）為3.77∶1，反應(yīng)時(shí)間為4.0 h進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)，平行試驗(yàn)4次，結(jié)果取平均值，測(cè)得SP的取代度DS的值為1.041，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，表明模型的可信度高，能夠很好地指導(dǎo)氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的反應(yīng)。

在相同條件下，以氯磺酸-吡啶為硫酸酯化試劑，取氯磺酸∶吡啶摩爾比1.385∶1對(duì)茯苓進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)[12]，平行試驗(yàn)4次，結(jié)果取平均值，測(cè)得SP的取代度DS的值為1.021。表明氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的結(jié)果與氯磺酸-吡啶法相當(dāng)。

2.4 ?SP的結(jié)構(gòu)表征

比較茯苓多糖和SP的紅外光譜圖（圖7）表明，SP除了具有茯苓多糖的相同的特征吸收峰外，還具有C-O-S（805 nm）、S=O（1 220～1 250 nm）的特征吸收[13]，表明以氨基磺酸為硫酸酯化試劑對(duì)茯苓多糖的硫酸酯化方法是可行的。

對(duì)比茯苓多糖和SP的紫外光譜圖（圖8、圖9）可知，SP除了在268 nm左右有-S-O-和-SO2 的吸收峰外，光譜圖與茯苓多糖相似，說(shuō)明SP無(wú)核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，純度較高，且有硫酸根基團(tuán)的特征吸收，硫酸酯化成功。

2.5 ?SP的抗凝血藥效試驗(yàn)結(jié)果

茯苓多糖硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性前后的抗凝血藥效試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，結(jié)果表明腹腔注射小白鼠SPⅡ組的全凝血時(shí)間為（122±13） s、出血時(shí)間為（193±12） s，全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率為43.5%，均明顯高于腹腔注射茯苓多糖Ⅰ組的全凝血時(shí)間、出血時(shí)間、延長(zhǎng)率。SP在小白鼠體內(nèi)腹腔注射給藥劑量對(duì)抗凝血活性的影響見(jiàn)表5。由表5可知，隨SP給藥劑量的增大，小白鼠的全凝血時(shí)間、全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率相應(yīng)增大，表明SP對(duì)小白鼠體內(nèi)凝血酶產(chǎn)生的抑制作用與其濃度呈正相互作用。茯苓多糖經(jīng)硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性后表現(xiàn)出良好的抗凝血活性。

3 ?小結(jié)

以中藥茯苓為原料通過(guò)稀堿浸提醇沉法獲得茯苓多糖，以氨基磺酸為酯化試劑對(duì)所獲得的茯苓多糖進(jìn)行硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性，制備硫酸酯化茯苓多糖，試驗(yàn)方法可行，試驗(yàn)結(jié)果與氯磺酸-吡啶法相當(dāng)。響應(yīng)面法優(yōu)化氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的反應(yīng)條件，得到最佳工藝為反應(yīng)溫度85 ℃、反應(yīng)時(shí)間4.0 h、氨基磺酸/多糖質(zhì)量比為3.77∶1，在此條件下，硫酸基團(tuán)取代度為1.041，與同樣條件下氯磺酸吡啶法制備的取代度1.021值相當(dāng)。經(jīng)Sephadex G-100柱層析精制后，紅外圖譜表明SP具有C-O-S（805 nm）、S=O（1 220～1 250 nm）的多糖及硫酸根基團(tuán)的特征吸收峰。紫外光譜掃描表明，SP無(wú)核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，純度較高，且有268 nm左右的-S-O-和-SO2的硫酸根基團(tuán)的特征吸收，表明硫酸酯化成功。茯苓多糖經(jīng)硫酸酯化結(jié)構(gòu)改性后表現(xiàn)出良好的抗凝血活性，其全凝血時(shí)間、出血時(shí)間、全凝血時(shí)間延長(zhǎng)率均明顯提高;隨著小白鼠腹腔注射給藥劑量的增大，其全凝血時(shí)間、延長(zhǎng)率均相應(yīng)明顯提高，SP對(duì)凝血酶產(chǎn)生的抑制作用與其濃度呈正相互作用。

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