遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用

遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用

王洪志,張一娜,武小薇

摘要:目的 探討遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(RIPC)對(duì)心肌細(xì)胞缺血再灌注(IR)損傷的保護(hù)作用,深入研究硫氧還蛋白(Trx)在RIPC信號(hào)通路中的作用。方法 選擇Wistar雄性大鼠72只隨機(jī)分為6組,分別為對(duì)照組、IR組、RIPC+IR組、Trx拮抗劑組、PI3K抑制劑組、單純RIPC組。制作RIPC和IR模型,采用稱(chēng)重法檢測(cè)心肌梗死范圍、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)改變,免疫組化法檢測(cè)Trx的表達(dá)。結(jié)果 對(duì)照組和單純RIPC組細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常;IR組、Trx拮抗劑組和PI3K抑制劑組心肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞呈大片狀壞死;RIPC+IR組心肌結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,局灶性心外膜下變性壞死,保護(hù)了心肌。與對(duì)照組和單純RIPC組比較,其他各組心肌凋亡率和梗死范圍顯著增加;IR組、Trx拮抗劑組、PI3K抑制劑組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與RIPC+IR組比較,IR組、PI3K抑制劑組和Trx拮抗劑組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。免疫組化,Trx在對(duì)照組低表達(dá),在IR組中度表達(dá),在RIPC+IR組、Trx拮抗劑組、PI3K抑制劑組和單純RIPC組高表達(dá)。結(jié)論 RIPC的心肌缺血再灌注保護(hù)作用可能通過(guò)升高Trx表達(dá),激活PI3K通路實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞:心肌缺血再灌注;遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng);硫氧還蛋白;細(xì)胞凋亡

中圖分類(lèi)號(hào):R542.2 R256.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.12.007

文章編號(hào):1672-1349(2015)12-1378-03

基金項(xiàng)目:黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.C類(lèi)QC2009C34);黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.11541160)

通訊作者:武小薇,E mail:wuxw75@163.com

收稿日期:(2015 02 19)

作者單位:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院(哈爾濱150086)

心肌缺血再灌注(IR)損傷廣泛存在于臨床,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康。1986年,Murry等[1]首先報(bào)道心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)有心臟保護(hù)作用,之后又發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)隔缺血預(yù)適應(yīng)(RIPC)也有類(lèi)似的心肌保護(hù)作用。RIPC可以減少細(xì)胞凋亡、梗死范圍和再灌注心律失常等,有保護(hù)心肌缺血再灌注作用[2,3]。RIPC是通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮心肌保護(hù)作用的呢?研究發(fā)現(xiàn)RIPC可以上調(diào)心肌保護(hù)性基因、蛋白水平[4,5]。隨著研究的深入,硫氧還蛋白(Trx)進(jìn)入了人們的視線。腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Trx有調(diào)節(jié)氧化還原平衡、促進(jìn)生長(zhǎng)、抗凋亡和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[6,7]。而抗氧化應(yīng)激、抑制凋亡和減弱炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)恰恰是防治再灌注損傷的重要切入點(diǎn)。本研究進(jìn)一步探討RIPC對(duì)心肌細(xì)胞IR損傷的保護(hù)作用,深入研究Trx在RIPC中作用。

1　材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 HX 300動(dòng)物呼吸機(jī),成都泰盟科技有限公司;RM6240B型多道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng),成都儀器廠;LY294002(PI3K抑制劑),碧云天生物技術(shù)研究所;PX 12(Trx拮抗劑),英國(guó)Tocris公司;SP Mouse HRP Kit鼠Streptavidi n HRP試劑盒、DAB Kit(DAB顯色試劑盒),北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司;Trx小鼠抗大鼠多克隆抗體,Santa公司;HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP標(biāo)記抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記抗山羊二抗,中衫金橋公司;凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(BIOTIN標(biāo)記POD法),凱基生物。

1.2 心肌I/R損傷模型 大鼠以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,連續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)碾妶D(ECG),氣管插管呼吸機(jī)輔助呼吸。沿胸骨左緣分離肋骨,暴露心臟,于左心耳下3 mm~4 mm略靠近動(dòng)脈圓錐處結(jié)扎前降支。缺血45 min后剪開(kāi)結(jié)扎線,再灌注180 min,為心肌I/R損傷模型。

1.3 RIPC模型 大鼠以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,選擇一側(cè)下肢小心分離出股動(dòng)脈,動(dòng)脈下穿線小心提拉5 min使血流中斷,放松10 min使血流恢復(fù),反復(fù)進(jìn)行3次后縫合皮膚,單獨(dú)飼養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將72只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為6 組,每組12只,其中4只檢測(cè)梗死范圍。對(duì)照組:建立RIPC模型,IR模型假手術(shù);IR組:RIPC模型假手術(shù),建立IR模型;RIPC+IR組:建立RIPC和IR模型;Trx拮抗劑組:建立RIPC和IR模型,再灌注前10 min注入Trx拮抗劑;PI3K抑制劑組:建立RIPC和IR模型,再灌注前10 min注入PI3K抑制劑;單純RIPC組:建立RIPC模型,IR模型假手術(shù)。Trx拮抗劑和PI3K抑制劑組在再灌注前10 min尾靜脈注藥,其余各組灌注生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 梗死面積 再灌注結(jié)束后伊文思藍(lán)溶液2 mL充分染色,沖洗后取下心臟漂洗干凈,吸干后剪取左心室,吸干后保鮮膜包裹,-20℃冷凍30 min均勻切成1 mm等厚的薄片,可見(jiàn)血供正常區(qū)著藍(lán)色,缺血危險(xiǎn)區(qū)不著色;分離并分別稱(chēng)重;然后將缺血危險(xiǎn)區(qū)置于2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中,37℃孵育20 min,10%中性甲醛溶液固定24 h。染成紅色為存活心肌,被甲醛漂成灰白色為壞死心肌。再次分離并分別稱(chēng)重。以梗死區(qū)重量占缺血危險(xiǎn)區(qū)重量的百分比來(lái)表示心肌梗死范圍的大小。公式為:心肌梗死面積=梗死心肌/缺血危險(xiǎn)區(qū)×100%

1.5.2 病理觀察 取距前降支結(jié)扎線遠(yuǎn)端約2 mm處左心室前壁組織,常規(guī)制作心肌標(biāo)本切片,光鏡下觀察大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用TUNEL試劑盒檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡。凋亡的心肌細(xì)胞核染成棕黃色,而未凋亡的顯深藍(lán)色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400倍),每個(gè)視野至少100個(gè)細(xì)胞,以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)求陽(yáng)性百分率,計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞率來(lái)反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。

1.5.4 免疫組化 半定量分析心肌Trx陽(yáng)性細(xì)胞百分比。在低倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)(×400)視野,分別計(jì)算這5個(gè)不同視野著色細(xì)胞的百分比及胞漿、胞核的著色程度,得分取其均值?；静稽S染定為0分,著色淡為1分,較深染色為2分;著色細(xì)胞百分比:≤5%計(jì)為0分,6%~25%計(jì)為1分,26%~50%計(jì)為2分,≥51%計(jì)為3分,最終得分計(jì)作每張切片染色細(xì)胞百分比得分×黃染程度得分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組均數(shù)及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析,以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 對(duì)照組和單純RIPC組心肌纖維呈束狀整齊分布,結(jié)構(gòu)完整,均勻著色,細(xì)胞形態(tài)正常。IR組、Trx拮抗劑組和PI3K抑制劑組心肌纖維排列紊亂,著色不均,心肌纖維少量斷裂,可見(jiàn)大片狀心肌壞死,細(xì)胞核有濃縮、破裂、溶解、消失現(xiàn)象,可見(jiàn)心肌間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。RIPC+IR組心肌纖維排列相對(duì)整齊,結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,著色較均勻;細(xì)胞核有輕度的濃縮、溶解現(xiàn)象,心肌間質(zhì)輕度水腫、少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 梗死范圍 與對(duì)照組和單純RIPC組比較,其他組梗死范圍顯著增大(P <0.05);與RIPC+IR組比較,IR組、PI3K抑制劑組和Trx拮抗劑組梗死范圍明顯增大(P<0.05);IR組、PI3K抑制劑組和Trx拮抗劑組3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1　各組心肌梗死范圍比較(x±s)　%

2.3 心肌細(xì)胞凋亡 對(duì)照組和單純RIPC組僅可見(jiàn)少量散在TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核,兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IR組、Trx拮抗劑組和PI3K抑制劑組均可見(jiàn)到典型TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核,心肌細(xì)胞凋亡明顯,成群分布,3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。與對(duì)照組和單純RIPC組比較,其他組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P <0.05);與RIPC+IR組比較,IR組、PI3K抑制劑組和Trx拮抗劑組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2　各組心肌細(xì)胞凋亡率比較(x±s)　%

2.4 免疫組化 與對(duì)照組比較,其他組Trx表達(dá)顯著增加(P<0.05);與IR組比較,RIPC+IR組、Trx拮抗劑組、PI3K抑制劑組和單純RIPC組Trx表達(dá)明顯增加(P<0.05),RIPC+IR組、Trx拮抗劑組、PI3K抑制劑組和單純RIPC組Trx表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3　各組Trx表達(dá)比較(x±s)

3　討 論

研究證實(shí),Trx作為一種氧化還原調(diào)節(jié)蛋白,廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中,在多個(gè)方面起到保護(hù)心肌缺血再灌注的作用:①調(diào)節(jié)氧化還原平衡:可以清除ROS,降低氧自由基的破壞;②與各種蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮抗凋亡促生長(zhǎng)作用,通過(guò)蛋白間的互動(dòng),Trx改變酶的活性或接觸蛋白如核因子κB(NF κB)的亞細(xì)胞定位,從而影響各種細(xì)胞功能[8];③調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng):類(lèi)趨化因子活性抑制白細(xì)胞聚集,發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫作用[9]。作為機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的防御反應(yīng),Trx可分泌到細(xì)胞外,發(fā)揮抗凋亡、抗炎作用保護(hù)細(xì)胞,以及作為自分泌/旁分泌因子促進(jìn)增長(zhǎng),影響到鄰近的細(xì)胞,并可能防止損傷擴(kuò)展[8]。RIPC保護(hù)心肌缺血再灌注途徑中,Trx發(fā)揮何種作用尚不完全明了。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)RIPC保護(hù)心肌缺血再灌注作用與Trx密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IR組缺血區(qū)心肌細(xì)胞大片狀壞死,伴廣泛的心肌細(xì)胞凋亡;大量細(xì)胞核濃縮、破裂、溶解、消失,心肌間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而RIPC+IR組梗死范圍、凋亡明顯減少,結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,證實(shí)RIPC起到了心肌保護(hù)作用,許多類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)也證明這種心肌保護(hù)作用[10,11]。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIPC+IR組Trx高表達(dá),接著對(duì)RIPC大鼠注入Trx拮抗劑PX12抑制Trx功能,發(fā)現(xiàn)Trx拮抗劑組大鼠出現(xiàn)類(lèi)似缺血再灌注樣改變。證實(shí)Trx參與了RIPC延遲相的心肌保護(hù)作用,抑制Trx的功能可以削弱RIPC對(duì)心肌IR的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIPC可以防止心肌缺血再灌注損傷,而在給予特異性PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY294002 后,細(xì)胞凋亡率和心肌梗死面積增加,抑制了RIPC的心肌保護(hù)作用。PI3K抑制劑可以抑制RIPC保護(hù)心肌的作用,提示PI3K信號(hào)通路在RIPC中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞生存密切相關(guān),研究表明,缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡能夠被高表達(dá)PI3K或Akt抑制[12]。PI3K可以激活A(yù)kt,激活后的Akt主要通過(guò)底物水平磷酸化,改變凋亡基因表達(dá)水平發(fā)揮抗凋亡、促細(xì)胞生存功能。激活的PI3K/Akt能夠阻斷許多刺激因子所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13,14]。有研究發(fā)現(xiàn)外源性Trx通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和對(duì)PI3K的激活保護(hù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞免受高氧癥誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[15]。

研究發(fā)現(xiàn)Trx和PI3K在腫瘤生成中存在上下游關(guān)系,這些提示在RIPC保護(hù)作用中,可能也存在這種上下游的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Trx和PI3K都與RIPC保護(hù)作用密切相關(guān),抑制PI3K或拮抗Trx的功能,都可以顯著削弱心肌保護(hù)作用;而PI3K抑制劑組Trx同樣高表達(dá),除外Trx位于PI3K下游的可能。推論RIPC延遲相的心肌保護(hù)作用可能通過(guò)升高Trx表達(dá),激活PI3K信號(hào)通路完成。

同時(shí),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RIPC還可以減輕細(xì)胞間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。有研究表明Trx有減輕炎癥的作用[9],將進(jìn)一步探討細(xì)胞凋亡與炎癥的相關(guān)性,以及Trx在其中的作用。

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(本文編輯郭懷印)