HPLC法測定補腎顆粒中馬錢苷的含量

摘要：目的 建立HPLC法測定補腎顆粒中馬錢苷的含量。方法 采用kromasil C18 5μm 4.6×250mm色譜柱，以乙腈-水（14∶86）為流動相，流速為1ml/min；檢測波長為236nm，柱溫為25℃。結(jié)果 線性范圍為6.384～63.84μg/ml（r2=0.9998），平均回收率為96.20%，RSD=0.7%。結(jié)論 所建立方法專屬性強、靈敏度高，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：補腎顆粒；馬錢苷；HPLC

補腎顆粒在《金匱要略》中腎氣丸和《小兒藥證直訣》中六味地黃丸、《醫(yī)學心悟》中二冬湯的基礎上根據(jù)祖國傳統(tǒng)中醫(yī)學理論并結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗化裁而成。處方由山茱萸、熟地、山藥、牡丹皮等十二味中藥材組成。山茱萸為方中君藥，具有補益肝腎、澀精固脫的功效，馬錢苷為其主要化學成分之一，因此研究選擇馬錢苷含量為測定指標。參照中國藥典[1]2005年版一部及相關(guān)文獻報道中馬錢苷[2]的含量測定方法，建立了本品中馬錢苷的高效液相色譜含量測定的方法。經(jīng)實驗研究，該方法靈敏、精密、重現(xiàn)性好，故本法可用于控制本品中山茱萸的含量。

1 儀器與試藥

Agilent1100高液相色譜儀；kromasil C18 5μm 4.6×250mm

色譜柱；FA2004N電子天平，Sartorius BT25S電子天平；島津UV-2101紫外分光光度計；SK250H超聲波清洗儀。

馬錢苷對照品（111640--200502 ）購自中國藥品生物制品檢定所。補腎顆粒批號：20090926、20090928、20090930、（自制）。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用kromasil C18 5μm；以乙腈-水（14∶86）為流動相，流速為1ml/min；進樣量20μl；檢測波長為236nm，柱溫為25℃。理論板數(shù)按馬錢苷峰計算應不低于3000。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取馬錢苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1ml含馬錢苷20μg 的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異下的本品，研細，取約1.2g，精密稱定，加60%甲醇25ml，超聲30min，放冷，補重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備 取缺山茱萸藥材的陰性樣品1.2g，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3系統(tǒng)適用性及陰性干擾試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各20μl，注入液相色譜儀，色譜見圖1。由圖1可知，在與對照品色譜峰保留時間相應的位置上，供試品有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照無色譜出現(xiàn)，故本品中其他組分對馬錢苷的含量測定無干擾。在該色譜條件下，馬錢苷分離效果較好，理論板數(shù)按馬錢苷計算不低于3000。

2.4精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下同一對照品溶液21.28μl，重復測定5次，結(jié)果：峰面積的相對標準偏差RSD=0.8%，表明本方法精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下同一供試品溶液21.28μl，分別于0、2、4、6、8進樣測定。結(jié)果RSD為0.7%，表明馬錢苷供試品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6線性關(guān)系考察 精密稱定馬錢苷對照品5.32mg，置25ml量瓶中，加60%甲醇至刻度；精密量取0.3ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml分別置10ml量瓶中，加60%甲醇到刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各20μl，照正文色譜條件下測定，記錄峰面積，以對照品的濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=34.982x+21.581，r2=0.9998。馬錢苷在6.384～63.84μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，

2.7重復性試驗 取同一批樣品（080926）精密稱定5份，按照“2.2.2”項下方法制定供試品溶液，分別進樣測定，計算馬錢苷，得馬錢苷平均含量為0.404mg/g粒，RSD=1.1%。表明本方法的重復性較好。

2.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的本品約0.2g，共五份，置容量瓶中，分別精密加入五份12.768μg的對照品0.6ml溶液，照含量測定項下的方法試驗，計算回收率，見表1。

2.9樣品含量測定 分別取各批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進樣測定，計算馬錢苷的含量，見表2。

7批樣品的平均含量為6.05mg/袋，考慮到實際生產(chǎn)中藥材來源的不同及批量生產(chǎn)等因素的影響，取含量均值的75%為含量下限，規(guī)定本品每袋含山茱萸以馬錢苷計，不得低于4.5mg。

3 討論

在超聲提取時間方面，筆者曾比較三種超聲時間，結(jié)果超聲20min樣品馬錢苷提取不完全，超聲30min與超聲50min樣品馬錢苷提取率相近，因此選擇超聲30min為提取條件。

在流動相方面，比較了三種流動相：①乙腈-水（15∶85）；②乙腈-水（10∶90）；③乙腈-水（14∶86）。結(jié)果以流動相③的出峰時間快，與雜質(zhì)峰分離好，峰形尖銳對稱。故選擇乙腈-水（14∶86）為本方法的流動相。

考慮到實際生產(chǎn)中藥材來源的不同及批量生產(chǎn)等因素的影響，取含量均值的75%為含量下限，規(guī)定本品每袋含山茱萸以馬錢苷計，不得低于4.5mg。

綜上所述，本試驗建立的含量測定方法可為補腎顆粒開展進一步的質(zhì)量標準研究工作提供基礎。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（第1部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：602.

[2]謝瑞芳，周昕.RP-HPLC 法測定復方自身清顆粒中馬錢苷的含量[J].中國藥房，2009，20（9）：679.

編輯/安樺