IL—1Ra和TGF—β基因聯(lián)合在骨關節(jié)炎治療中的應用

摘要：目的 骨關節(jié)炎治療中IL-1Ra和TGF-β基因聯(lián)合治療效果。方法 研究選取新西蘭大白兔關節(jié)軟骨，將軟骨細胞分為轉染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組、轉染TGF-β1組、轉染IL-1Ra組，對比組織學指標。結果 LI-1Ra+TGF-β1組TNF-α、IL-1β含量均顯著低于TGF-β1組、IL-1Ra組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。轉TGF-β1組阿爾新藍染色尚呈均一表現(xiàn)，HE染色細胞呈紊亂排列，數(shù)量有減少，中間層和表層細胞有簇集顯示。為棕黃色Ⅱ型膠原免疫組化胞漿，觀察基質染色，呈較深表現(xiàn)。轉IL-Ra組細胞在表層和中間層稍簇集，排列稍紊亂，阿爾新藍染色呈均一表現(xiàn)，為棕黃色Ⅱ型膠原免疫組化漿，基質染色相對較深。結論 經(jīng)脂質體對TGF-β1和IL-1Ra基因向軟骨細胞介導，與致炎軟骨塊共培養(yǎng)，得出轉基因組對炎性因子具降低作用，相較單基因，雙基因效果更為明顯，可對關節(jié)軟骨退變抑制，發(fā)揮理想治療OA作用。

關鍵詞：IL-Ra；TGF-β；基因聯(lián)合；骨關節(jié)炎

骨性關節(jié)炎（OA）是對中老年人健康構成嚴重威脅的一種進行性、無菌性、慢性侵犯關節(jié)的疾病類型，病理核心為關節(jié)面軟骨退行性改變，目前尚無理想治療手段[1]?；蜣D移技術對基質合成和骨軟骨生長具有促進作用，可使靶細胞大量對骨軟骨生長調控因子表達。本次就IL-Ra和TGF-β基因聯(lián)治成效展開研究，現(xiàn)總回顧如下。

1 資料與方法

1.1一般材料 選取2只新西蘭大白兔，體重約6 kg和2 kg。取pEGFP-TGF-β1和PEGFP–IL-1Ra表達質料，0.25%胰蛋白酶、0.2%Ⅱ型膠原酶。熒光顯微鏡。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)軟骨細胞 無菌條件下，取正常膝、肩關節(jié)軟骨，應用D-Hanks液實施漂洗操作后剪碎，使其呈糊狀，取0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDFA）加入，在溫心中行30 min孵化，離心，將上清棄去，在37℃溫箱中，取0.2%Ⅱ型膠原酶加入，消化4 h，細胞每隔2 h收集一次，過濾，將上清棄除，行2次漂洗，將細胞收集，取高糖DMEM培養(yǎng)基加入，殘渣繼續(xù)在膠原酶中消化，細胞收集完成后，均勻在培養(yǎng)瓶中接種，培養(yǎng)。

1.2.2脂質體轉染 以密度1.5×105將軟骨細胞在6孔培養(yǎng)板接種，按轉染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組、轉染TGF-β1組、轉染IL-1Ra組劃分，行細胞培養(yǎng)。對收集的培養(yǎng)基TGF-β1與IL-1Ra，行ELISA檢測。

1.3統(tǒng)計學分析 文中涉及數(shù)據(jù)均在SPSS 13.0中輸入，組間計數(shù)資料采用（x±s）表示，計量資料行t檢驗，計數(shù)資料行χ2檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 TNF-α、IL-1β含量比較 LI-1Ra+TGF-β1組TNF-α、IL-1β含量均顯著低于TGF-β1組、IL-1Ra組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2組織學分析 轉TGF-β1組阿爾新藍染色尚呈均一表現(xiàn)，HE染色細胞呈紊亂排列，數(shù)量有減少，中間層和表層細胞有簇集顯示。為棕黃色Ⅱ型膠原免疫組化胞漿，觀察基質染色，呈較深表現(xiàn)。轉IL-Ra組細胞在表層和中間層稍簇集，排列稍紊亂，阿爾新藍染色呈均一表現(xiàn)，為棕黃色Ⅱ型膠原免疫組化漿，基質染色相對較深。

3 討論

現(xiàn)階段，應用病毒載體，可將基因成功向細胞中轉染，關于OA采用病毒載體攜帶治療基因處理的實驗，臨床已較多，但針對OA此種非致病性、慢性的疾病而言，取病毒載體應用，有一定局限性，故對在慢性疾病治療中的應用有所限 制[2]。非病毒載體無免疫原性和毒性，易合成，容量大、可生物降解、安全性好、穩(wěn)定實用，可同時對多種治療基因傳輸，但有待提高其轉染效率。有研究應用轉染的脂質體復合物TGF-β1基因入原代軟骨細胞及軟骨膜細胞，可達70%效 率[3]，在骨軟骨缺損模型中植入，缺損處在1 w后仍對TGF-β1表達，提示對非病毒轉染方法改進，效果較高，可使臨床應用距離縮短。

針對OA動物模型展開實驗，IL-1Ra基因為研究熱點，其對關節(jié)軟骨的退變具延緩價值已被體外、體內實驗證實[4]。除單基因外，聯(lián)合多基因對OA的治療近年報道漸趨增多，Nixon等研究示，IL-Ra與IGF-1基因聯(lián)合，可減少基質丟失、加強軟骨基質合成，對OA軟骨基質損傷有逆轉作用。有研究示[5]，采用ELISA對培養(yǎng)基IL-1Ra與TGF-β1表達量測定，在單基因組和雙基因組，IL-1Ra或TGF-β1均有高表達，提示轉染軟骨細胞基因對表達可獲取。本次研究中，LI-1Ra+TGF-β1組TNF-α、IL-1β含量均顯著低于TGF-β1組、IL-1Ra組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示雙基因組對TNF-α、IL-1β的降低能力顯著優(yōu)于單基因組，聯(lián)合LI-1Ra、TGF-β1，對促炎性因子表達水平降低具有一定可行性，臨床可依據(jù)動物實驗研究結果，指導臨床治療，以使患者預后得到最大程度改善。

對組織學特征展開觀察，因炎性因子作用，在未轉染組，軟骨細胞破壞呈增多顯示，細胞外基質及膠原纖維分泌合成減少，故染色有變淡表現(xiàn)，與OA特征符合。而染色在基因治療組呈加重顯示，提示軟骨細胞在基因治療組明顯增多，合成的細胞外基質和膠原纖維也有增加[6]。觀察染色變化，轉基因組對致炎軟骨塊具修復效果。

綜上，經(jīng)脂質體對TGF-β1和IL-1Ra基因向軟骨細胞介導，與致炎軟骨塊共培養(yǎng)，得出轉基因組對炎性因子具降低作用，相較單基因，雙基因效果更為明顯，可對關節(jié)軟骨退變抑制，發(fā)揮理想治療OA作用。

參考文獻：

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編輯/羅茗柯