EGF—Linker—TCSKDEL融合蛋白的構建及表達產(chǎn)物的純化

摘要：目的 構建EGF-Linker-TCSKDEL融合蛋白表達載體并純化目的蛋白。方法 以天花粉蛋白基因的改造產(chǎn)物TCSKDEL為毒素，人表皮生長因子EGFR為載體，構建重組免疫毒素 EGF-Linker-TCSKDEL。PCR方法擴增 EGF-Linker-TCSKDEL 基因片段，插入表達載體PET28a中并誘導表達，使用Ni-NTA Agrose親合層析純化。結果 該融合蛋白以可溶形式表達于大腸桿菌培養(yǎng)上清中，并獲得有效純化。結論 成功構建了新型融合蛋白EGF-Linker-TCSKDEL，為其進一步的基礎和臨床研究奠定基礎。

關鍵詞：融合蛋白； 表皮生長因子；天花粉蛋白

Construction and Purification of EGF-Linker-TCSKDEL Fusion Proteins

LI Yu-ping

（School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

Abstract：Objective To construct the expression vector of EGF-Linker-TCSKDEL fusion proteins and purify target protein. Methods Recombinant immunotoxin （EGF-Linker-TCSKDEL） was constructed by modified trichosanthin （TCS） with KDEL as toxin and epidermal growth factor （EGF） as a carrier. The DNA fragment of EGF-Linker-TCSKDEL was amplified by using PCR， and the fusion proteins were purified by Ni-NTA Agrose affinity chromatography. Results The fusion protein was expressed in a form of soluble protein and purified effectively using affinity chromatography. Conclusion A new EGF-Linker-TCSKDEL fusion proteins was successfully prepared. It laid a foundation of further research in basic and clinical of EGF-Linker-TCSKDEL.

Key words：Fusion protein；Epidermal growth factor；Trichosanthin

天花粉蛋白（Trichosanthin ，TCS）是從葫蘆科植物栝樓塊根中提取的I型核糖體滅活蛋白[1]，臨床常用于中期妊娠引產(chǎn)。深入研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白在體內(nèi)體外對多種腫瘤細胞具有細胞毒性，可以充當配子用于生物導彈[2、3]。人表皮生長因子（EGF）是一種重要的生長因子，它的過度表達常與許多惡性腫瘤的預后差、轉移快和生存期短等有關[4，8]。EGF受體抑制劑可能是通過促進細胞凋亡、抗血管生成、抗細胞分化增殖和遷移等方面而實現(xiàn)其抗腫瘤的作用[9]。EGF可以競爭結合癌細胞表面受體，所以，EGF可以作為融合蛋白的配子，攜帶毒素特異的殺傷癌細胞[10]。KDEL是一段高疏水的序列，PE毒素的C末端加上KDEL序列可以顯著提高PE殺傷腫瘤細胞的作用。我們設想將KDEL序列加在TCS的C末端可能提高TCS抗腫瘤的活性，本研究擬將KDEL序列加在EGF-Linker-TCS的C末端，構建并純化該融合蛋白，為探索該重組融合蛋白在腫瘤治療方面的潛力，研究相關作用機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1質粒、菌株及試劑 克隆菌JM105、表達菌M15及EGF-linker-TCS由本室保存；工具酶及限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；純化試劑盒購自QIAGEN公司，兔抗6HIS，羊抗兔IgG購自深圳勤保升生物科技有限公司。

1.2 EGF-Linker-TCSKDEL基因的擴增 參照楊海文博士[11]設計引物，在EGF的N端加上六個HIS的序列用于親合層析，TCS的C端加上KDEL的編碼序列（斜體）：5′-gcgcccatgggacatcatcatcatcatcacaactccgactccgaatgtccg-3′ 5′- cgcgaattcttacagttcatcttttgc catcttgtttcg-3′，PCR擴增條件為94℃30s， 60℃30s， 72℃40s；72℃延伸5Min ，PCR擴增結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 EGF-linker-TCSKDEL基因的克隆及表達載體的構建 用QIAGEN公司的PCR產(chǎn)物快速純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，，NcoI內(nèi)切酶酶切，EcoRI內(nèi)切酶酶切PET28a表達載體，回收酶切片段。將回收的片斷用T4DNA連接酶連接，轉化JM105宿主菌中。

1.4 EGF-linker-TCSKDEL的表達及免疫印跡分析 將鑒定的重組質粒轉化至M15表達菌，挑單菌落接種，37℃搖床培養(yǎng)8h。而后取該培養(yǎng)物按比例接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6時，加入IPTG誘導表達3h，取樣做SDS-PAGE分析，薄層掃描測定目的蛋白表達量。將誘導表達后的重組蛋白200ug及M15菌體蛋白（陰性對照）轉印至硝酸纖維素膜上，BSA封閉，與一抗（His）反應1h，PBS洗滌后與二抗反應1h，緩沖溶液洗滌后DAB顯色[12]。

1.5 EGF-Linker-TCSKDEL的純化 IPTG誘導大腸桿菌表達EGF-linker-TCSKDEL3 h，超聲波破碎菌體，離心后取上清液，用Ni-NTA Agrose親和純化，純化的樣品做聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結果

2.1 EGF-linker-TCSKDEL的PCR擴增 擴增的EGF-linker-TCSKDEL基因純化后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在900bp處可見特異性擴增帶，見圖1。

圖1 EGF-linker-TCSKDEL的PCR擴增

2.2 EGF-linker-TCSKDEL表達載體的構建 與pET28a載體連接的EGF-linker-TCSKDEL基因片段轉化至JM105菌后經(jīng)PCR鑒定為陽性菌落，擴大培養(yǎng)，提取質粒。用SphI/EcoRI和NcoI/EcoRI雙酶切鑒定，在750bp和900bp處可見條帶，見圖2。

圖2 重組子的限制性酶切鑒定

2.3 EGF-Linker-TCSKDEL基因的表達及純化和免疫印跡分析 IPIG誘導表達的工程菌經(jīng)SDS-PAGE顯示有蛋白帶，相對分子質量為31000，而未經(jīng)誘導的工程菌在此處未見蛋白帶，見圖3。Western blotting分析結果顯示IPIG 誘導表達的工程菌樣品在NC膜其相應分子質量處可見特異性帶，而未經(jīng)誘導的工程菌未見特異帶，見圖4。

3 討論

免疫毒素（ immunotoxins ）是一組人工構建的具有特異性殺傷靶細胞能力的雜合分子，在細胞培養(yǎng)水平能選擇性結合并殺傷腫瘤細胞[13]。免疫毒素可特異性殺傷靶細胞，而對正常細胞無毒害作用，因此，作為最具代表性的靶向治療藥物，其在治療腫瘤和自身免疫性疾病及抗免疫排斥反應等方面具有良好的應用前景[14，15]。天花粉蛋白屬于I型核糖體失活蛋白，只有A鏈，沒有與細胞結合的B鏈，單獨的天花粉蛋白很難進入細胞，因此對完整細胞的毒性很低[16]。所以，把單鏈毒素和單克隆抗體偶聯(lián)或與細胞因子連接后形成雜交分子，能特異性地殺傷靶細胞，從而在靶向治療中有廣泛的應用價值。

李詠梅[17]克隆了EGF-Linker-TCS，并初步探討了其抗腫瘤的功效。結果顯示EGF-Linker-TCS可以抑制荷瘤小鼠瘤體的生長，其抗腫瘤的功效與誘導癌細胞的凋亡及抑制腫瘤血管的生成有關。為提高融合蛋白的活性，本文在EGF-Linker-TCS的基礎上，成功的構建融合蛋白EGF-Linker-TCSKDEL并在大腸桿菌中高效表達，試圖為腫瘤的靶向治療提供療效更好、特異性更強的融合蛋白。本研究中我們使用PCR方法將KDEL序列加在TCS的C末端提高重組蛋白的活性，同時使用了含T7啟動子和終止子的載體PET28a，表達更高效穩(wěn)定，為下一步高密度發(fā)酵打下基礎

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編輯/馮焱