頭孢他啶與中藥制劑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)銅綠假單胞菌的體外抗菌活性的研究

摘要：目的 研究頭孢他啶和雙黃連注射液、熱毒寧注射液、喜炎平注射液聯(lián)合應(yīng)用抗臨床分離的銅綠假單胞菌的效果。方法 收集并分離臨床來源的68株銅綠假單胞菌，采用微量棋盤稀釋法，計(jì)算頭孢他啶分別和3種中藥制劑的FIC指數(shù)。結(jié)果 采用頭孢他啶和熱毒寧注射液聯(lián)用，以相加（11.76%）和無關(guān)（58.82%）作用為主，以協(xié)同（10.29%）和拮抗（8.82%%）為次。采用頭孢他啶和雙黃連注射液聯(lián)用，以無關(guān)（36.76%）和相加（20.59%）作用為主，以協(xié)同（11.76%）和拮抗（16.18%）為次。頭孢他啶與喜炎平注射液聯(lián)用抗銅綠假單胞菌無效。結(jié)論 在臨床治療過程中，可以佐以中藥制劑以增強(qiáng)抗菌藥物治療的有效性。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌；聯(lián)合用藥；微量棋盤稀釋法

Study on Antibacterial Activity of Ceftazidime with Traditional Chinese Medicine Preparation Combined Application of Pseudomonas Aeruginosa in Vitro

LV Juan， XIE Fen，DING Yong-juan

（Affiliated Hospital of Jiangnan University， Wuxi N0’4 People's Hospital， Wuxi 214062，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To study the effect of antibacterial action combined with ceftazidime and Shuanghuanglian injection， Reduning injection， Xiyanping injection on Pseudomonas Aeruginosa. Methods To collect and isolate the 68 strains of Pseudomonas Aeruginosa in clinical， the fractional inhibitory concentration index was calculated with microdilution checkerboard method， about ceftazidime and Shuanghuanglian injection， Reduning Injection， Xiyanping Injection. Results The effect of antibiotics combination of ceftazidime and Reduning Injection was 11.76% additive and 58.82% independent action， while 10.29% was synergistic effect and 8.82% was antagonistic effect. The effect of antibiotics combination of ceftazidime and Shuanghuanglian Injection was 20.59% additive and 36.76% independent action， while 11.76% was synergistic effect and 16.18% was antagonistic effect. It is ineffective for us to combine ceftazidime with Xiyanping injection. Conclusion In the clinical course of treatment， chinese medicine preparation can be used to enhance the effectiveness of antimicrobial therapy.

Key words：Pseudomonas aeruginosa；Combination；Microdilution checkerboard method

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是假單胞菌中最常見的條件致病菌，是我院培養(yǎng)分離出的前三個(gè)病原菌之一。PA感染難以治療，甚而產(chǎn)生多重耐藥、泛耐藥菌株，有相當(dāng)部分原因是因?yàn)殂~綠假單胞菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜。當(dāng)單一抗菌藥物的使用無法有效的治療銅綠假單胞菌感染時(shí)，臨床通常選擇不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用來治療PA感染，以減少單一藥物大劑量應(yīng)用時(shí)的毒副作用，以及減少和延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。丁力等[1]評(píng)價(jià)了異帕米星分別與頭孢他定、頭孢吡肟、美洛培南聯(lián)合用藥對(duì)臨床分離獲得的PA的體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)上述藥物聯(lián)用后，明顯起到增效作用，主要表現(xiàn)為協(xié)同和相加作用。另有研究[2]表明頭孢他啶與環(huán)丙沙星的聯(lián)合對(duì)多重耐藥PA的敏感率為88.46%，哌拉西林他唑巴坦與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)多重耐藥PA的敏感率為84. 26%。

除了各種抗菌藥物之間聯(lián)合應(yīng)用治療銅綠假單胞菌感染外，同樣有研究表明，中藥能夠增加抗菌藥物的效應(yīng)，提高菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。任玲玲等[3]研究表明，中藥復(fù)方制劑能降低大腸埃希菌多重耐藥基因表達(dá)水平；而蘆亞君等[4]研究中藥復(fù)方制劑能使產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌部分或全部逆轉(zhuǎn)對(duì)抗菌藥物的耐藥性的作用。中西藥物的聯(lián)合應(yīng)用研究被逐漸提上議事日程。通過中西藥物聯(lián)合應(yīng)用來達(dá)到提高抗菌藥物使用療效，縮短住院時(shí)間，降低耐藥率的目的。銅綠假單胞菌是一種常見的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的條件致病菌，我院通常選擇靜脈注射類抗菌藥物治療PA感染，頭孢他啶在美國FDA 核準(zhǔn)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室在非苛養(yǎng)菌常規(guī)試驗(yàn)和報(bào)告中應(yīng)考慮的抗微生物藥物推薦分組中，是首先被推薦用于治療銅綠假單胞菌的藥物，故本研究選用頭孢他啶與臨床常用中藥制劑雙黃連注射液、熱毒寧注射液、喜炎平注射液聯(lián)用，觀察對(duì)銅綠假單胞菌有無協(xié)同抗菌作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年9月～2011年8月我院臨床分離的68株P(guān)A，全部菌株采用VITEK 32型全自動(dòng)微生物分析儀，GNI鑒定卡進(jìn)行鑒定。68例住院患者中，男50例，女18例；年齡38～96歲，平均（68±13）歲；60歲以上44例，占64.71%。

1.2培養(yǎng)基和抗菌藥物 Mueller Hinton肉湯培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱MH培養(yǎng)基）（江蘇宜興市永信生物有限公司，批號(hào)：20100518）；頭孢他啶（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào)：101130）；雙黃連注射液（1mL相當(dāng)于1g生藥）（河南福森藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100734）；熱毒寧注射液（1mL藥液含梔子9～14mg和綠原酸5.6～8.4mg）（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：100807）；喜炎平注射液（江西青峰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20110124）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 SW-CJ-ICU潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：HH-BII-360-S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；手提式不銹鋼蒸汽消毒鍋（型號(hào)：YX20B）。

1.4 微量棋盤稀釋法

1.4.1原理 將甲乙兩藥的各種稀釋度加以組合，組成聯(lián)合藥敏板。同時(shí)兩種藥物每一稀釋度都有一個(gè)加單一藥物的單獨(dú)藥敏孔。根據(jù)單一藥物對(duì)被檢菌的MIC和聯(lián)合藥敏板中的抑菌情況，可精確測(cè)定兩藥在適當(dāng)濃度比例下所產(chǎn)生的相互作用。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.2.1確定單藥的MIC。

1.4.2.2確定聯(lián)合藥敏的藥物稀釋度 ①每一稀釋度濃度為聯(lián)合藥敏孔內(nèi)所需單藥終濃度的2倍；②用MH液體培養(yǎng)基將甲乙兩藥稀釋6～8個(gè)稀釋度。

1.4.2.3加甲、乙兩藥（分別從橫、豎排加入） 每孔各50ul，橫排和縱排的第1孔為無藥對(duì)照，第1排為單藥對(duì)照管。見圖1。

1.4.2.4加待測(cè)菌液 ①各管加入被檢菌液100ul；②菌液終濃度：105CFU/mL。

1.4.2.5將塑料96孔板放入37℃孵育過夜。

1.4.2.6結(jié)果判讀：FIC：部分抑菌濃度指數(shù)。

FIC指數(shù)=甲藥聯(lián)合時(shí)MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)MIC

FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用；0.52.0為拮抗作用[1]。

2 結(jié)果

采用頭孢他啶和熱毒寧注射液聯(lián)用，以相加（11.76%）和無關(guān)（58.82%）作用為主，以協(xié)同（10.29%）和拮抗（8.82%）為次。采用頭孢他啶和喜炎平注射液聯(lián)用，所有FIC均大于2，以拮抗（100%）作用為主，無協(xié)同、相關(guān)及無關(guān)作用。采用頭孢他啶和雙黃連注射液聯(lián)用，以無關(guān)（36.76%）和相加（20.59%）作用為主，以協(xié)同（11.76%）和拮抗（16.18%）為次。具體見表1。

3 討論

細(xì)菌的耐藥性問題目前已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，以往臨床上大多數(shù)感染應(yīng)用單一抗菌藥物即可控制，但是隨著細(xì)菌耐藥率的逐年遞增，單一抗菌藥物并不能對(duì)許多嚴(yán)重的感染進(jìn)行良好的控制。2011年衛(wèi)生部在全國范圍內(nèi)開展了抗菌藥物臨床應(yīng)用專項(xiàng)整治活動(dòng)，提出3級(jí)醫(yī)院抗菌藥物品種原則上不超過50種。細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生的速度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于抗菌藥物的研制速度，醫(yī)院目錄內(nèi)的抗菌藥物不僅要滿足臨床治療的要求，能夠保證治療各類病原微生物感染的用藥，而且要盡可能被合理使用，有效控制細(xì)菌耐藥。本人之前研究[5]表明，銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶對(duì)的耐藥率超過了30%，針對(duì)銅綠假單胞菌采用聯(lián)合用藥，明確銅綠假單胞菌對(duì)中西藥聯(lián)用的效果顯得尤為重要。

目前有熱毒寧注射液聯(lián)合頭孢呋辛[6]、美洛西林舒巴坦鈉[7]等治療治療化膿性扁桃體炎，聯(lián)合克林霉素[8]治療小兒急性支氣管炎等的療效觀察報(bào)道，但這些病癥的病原微生物檢驗(yàn)多為鏈球菌、葡萄球菌。有研究[7]表明，熱毒寧注射液聯(lián)合美洛西林舒巴坦鈉用于治療急性化膿性扁桃體炎總有效率100%，兩藥聯(lián)用具有優(yōu)勢(shì)，特別是對(duì)美洛西林舒巴坦鈉耐藥者，聯(lián)合使用熱毒寧注射液后仍有好轉(zhuǎn)療效，值得推廣應(yīng)用。但該研究的184例觀察病例中，檢出銅綠假單胞菌的僅有2例，且該研究沒有明確這2例屬于治療組。文獻(xiàn)[9]指出熱毒寧聯(lián)合頭孢呋辛鈉治療兒童社區(qū)獲得性肺炎可縮短療程，提高有效率，可能與社區(qū)獲得性肺炎常見的病原體復(fù)雜[10]，多為細(xì)菌、非典型感染、肺炎支原體合并細(xì)菌或病毒等感染有關(guān)。以上研究表明，熱毒寧注射液雖然常用于治療呼吸道感染，但呼吸道感染的原因是細(xì)菌、支原體合并病毒感染者，使用熱毒寧注射液較有效。由表1可知，熱毒寧注射液與頭孢他啶聯(lián)用，以無關(guān)作用（58.82%）為主，協(xié)同和相加作用為次，表明熱毒寧注射液具有協(xié)同抗PA的作用，但仍以頭孢他啶自身抗PA作用為主。這與臨床多以熱毒寧注射液抗病毒治療[11-13]為主相一致。

喜炎平注射液主要成份是穿心蓮內(nèi)酯總酯磺化物，主要治療支氣管炎、扁桃體炎、細(xì)菌性痢疾等疾病。穿心蓮內(nèi)酯系自爵床科植物穿心蓮中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物，具有良好的抗感染作用，但作用機(jī)制尚不明確。郭威等[14]通過含有LacZ報(bào)告基因質(zhì)粒的感因菌株檢測(cè)了穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌C14-HSL分子的抑制作用，并未發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)MexAB-OprM外排泵mRNA水平表達(dá)的抑制作用機(jī)制。有研究表明[15]，穿心蓮內(nèi)酯可以通過減弱對(duì)胞外水解酶和彈性蛋白酶的活性，抑制銅綠假單胞菌毒力因子產(chǎn)生從而實(shí)現(xiàn)抗感染作用；也有文獻(xiàn)[16]認(rèn)為，穿心蓮內(nèi)酯與阿奇霉素有協(xié)同抗菌作用；但穿心蓮提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果較差[17]。本研究認(rèn)為頭孢他啶與喜炎平注射液聯(lián)用無抗銅綠假單胞菌作用，與上部分內(nèi)容喜炎平注射液在體外無抗銅綠假單胞菌作用一致，可能本研究使用的是喜炎平注射液，成分為穿心蓮內(nèi)酯總酯磺化物，與穿心蓮內(nèi)酯有一定區(qū)別有關(guān)。

雙黃連制劑的研究較多，有文獻(xiàn)[18]報(bào)道雙黃連對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌有一定的抑制作用；雙黃連與頭孢噻肟合用[19]，比單用頭孢噻肟對(duì)銅綠假單胞菌的敏感度提高2～8倍。有研究[20-21]認(rèn)為，對(duì)于多重耐藥感染PA進(jìn)行聯(lián)合用藥經(jīng)驗(yàn)治療時(shí)，可優(yōu)先考慮頭孢他啶聯(lián)合環(huán)丙沙星，其次哌拉西林他唑巴坦鈉聯(lián)合環(huán)丙沙星，其抗菌機(jī)制可能與聯(lián)合用藥后抗菌藥物之間的耐藥機(jī)制并不完全重疊，聯(lián)合用藥后破壞了銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制有關(guān)。本研究中的雙黃連注射液為中藥金銀花、黃芩、連翹的提取物制劑，類似小型復(fù)方，與文獻(xiàn)中的雙黃連粉針有一定區(qū)別，協(xié)同、相加、無關(guān)、拮抗等作用的分布也較為平均，可能與其多成分多靶點(diǎn)作用機(jī)理有關(guān)。雙黃連注射液與頭孢他啶聯(lián)用，協(xié)同和相加抗PA的有效率超過了30%，兩藥聯(lián)用抗PA的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

在實(shí)驗(yàn)過程中，有一些菌株無法判定頭孢他啶與中藥制劑聯(lián)用的FIC值，是因?yàn)橹兴幹苿┰趩斡脮r(shí)的最大濃度亦沒有抑菌作用，即無法得知中藥制劑在單用時(shí)的MIC值，進(jìn)而無法判讀頭孢他啶與其聯(lián)用的FIC值。

頭孢他啶是β-內(nèi)酰胺類抗生素，細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。頭孢他啶和雙黃連注射液聯(lián)用具有協(xié)同和相加抗PA的作用，作者將繼續(xù)研究雙黃連注射液是否能抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，從而增加敏感性，降低耐藥率。

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