Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制的實(shí)驗(yàn)研究

?

Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制的實(shí)驗(yàn)研究

王海東1謝建祥2林偉青1#

（1江西省人民醫(yī)院南昌330006；2江西省兒童醫(yī)院南昌330006）

摘要：目的：通過體外酶學(xué)試驗(yàn)分析Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響及抑制機(jī)理。方法：利用紫外分光光度計(jì)觀測尿酸生成導(dǎo)致的吸光度變化值，測定波長為292 nm，并以黃嘌呤為底物根據(jù)測定結(jié)果繪制Lineweaver-Burk和Dixon圖。結(jié)果：Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶表現(xiàn)很強(qiáng)的抑制作用，其Ki值為0.128 6 μg/ml，抑制類型為混合型；而別嘌呤醇作為對(duì)照，其Ki值為0.62 μg/ml，抑制類型為競爭性抑制。結(jié)論：Eupatilin具有明顯的黃嘌呤氧化酶抑制活性。

關(guān)鍵詞：異澤蘭黃素；黃嘌呤氧化酶；黃嘌呤；活性抑制

隨著國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)的變化及人口老齡化，近年來我國痛風(fēng)發(fā)病率呈明顯上升的趨勢(shì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)的根本病因是嘌呤代謝紊亂，血（尿）中嘌呤代謝最終產(chǎn)物即血尿酸水平持續(xù)增高。臨床治療痛風(fēng)多使用秋水仙堿、非甾體類抗炎藥、皮質(zhì)類固醇、黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑等，雖然能控制癥狀，在一定程度上延緩病情，但由于對(duì)體內(nèi)病理性產(chǎn)物缺乏清除或轉(zhuǎn)化，而且還有藥物的不良反應(yīng)，所以難以達(dá)到理想的治療效果。別嘌呤醇是臨床上最常應(yīng)用的黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑，但在臨床使用中發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇可能導(dǎo)致肝炎、超敏變態(tài)反應(yīng)等較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者因害怕而依從性差，因此研究出更安全可靠的方法，發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，是我們面臨的一個(gè)難題。Eupatilin（異澤蘭黃素）是從一種復(fù)方制劑中提取出的藥物DA-9601的主要活性成分，在韓國已應(yīng)用于護(hù)肝、抗氧化、抗炎及抗菌。本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶有很強(qiáng)的抑制作用，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了更為詳細(xì)的體外酶學(xué)試驗(yàn)，研究分析其對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器紫外分光光度計(jì)（島津UV1800型）、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（東京理化）、電子天平、876A-2型數(shù)顯真空干燥箱。

1.2試劑Eupatilin（上海純優(yōu)生物科技有限公司），黃嘌呤氧化酶（sigma公司），黃嘌呤（sigma公司），別嘌呤醇（sigma公司），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸氫二鈉（分析純）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液配制

2.1.1磷酸鹽緩沖液（PBS）配制精密稱取Na2HPO414.20 g和KH2PO42.72 g，加入蒸餾水配成濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液500 ml，將pH值調(diào)至7.5。

2.1.2別嘌呤醇（A）液配制精密稱取別嘌呤醇2 mg，用PBS（pH=7.5）100 ml溶解，配制成濃度為20 μg/ml的別嘌呤醇溶液備用。

2.1.3黃嘌呤（X）液配制精密稱取氫氧化鈉0.06 g，用8 ml蒸餾水溶解，得到氫氧化鈉溶液，再加入精密稱取的黃嘌呤0.057 g，即為黃嘌呤氫氧化鈉溶解液（a液）。精密稱取磷酸二氫鉀0.27 g，用10 ml蒸餾水溶解，獲得磷酸二氫鉀液（b液）。將a液、b液混合后，加蒸餾水稀釋至40 ml，再用PBS（pH=7.5）稀釋至100 ml。精密量取8 ml，加入PBS液（pH=7. 5）稀釋至66.667 ml，即得到1 mmol/L的X液。

2.1.4黃嘌呤氧化酶（XO）液配制精密量取黃嘌呤氧化酶40 μl（1 U），加PBS（pH=7.5）稀釋至2 ml，即得0.5 U/ml的XO液。

2.1.5 Eupatilin（異澤蘭黃素）液配制精密稱取1 mg Eupatilin加入50 μl二甲亞礬（DMSO）溶解后（DMSO最終濃度＜1%），再用PBS（pH= 7.5）配制成0.4 mg/ml的Eupatilin溶液備用。

2.2黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)

2.2.1光密度值每分鐘變化A值測定取0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液400 μl，分別加入濃度為1 mmol/L的X液60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，振蕩2 min后再加入200 μl即0.1 U的黃嘌呤氧化酶溶液（已預(yù)溫至25℃）渦旋混勻后，用紫外分光光度計(jì)觀測292 nm處該反應(yīng)體系在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，連續(xù)測定15 min，每分鐘測定1次，以時(shí)間與吸光度進(jìn)行線形回歸，計(jì)算斜率Rate值（dA/min）。每個(gè)樣品重復(fù)操作3次，取其平均值。

2.2.2光密度值每分鐘變化B值測定在60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl濃度為1 mmol/L的X液的各試管中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液300 μl后再分別加入Eupatilin液各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl；陽性對(duì)照加入別嘌呤醇液各12.5μl、25 μl、50 μl、100 μl；空白對(duì)照則加入DMSO各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl，然后在每個(gè)試管中加入200 μl的XO液，各試管的總體積為1 ml。

2.2.3黃嘌呤氧化酶活性的計(jì)算以公式（1－B/A）×100%，計(jì)算黃嘌呤氧化酶活性抑制百分率。

2.2.4 Ki值計(jì)算用Dixon繪圖法計(jì)算Ki值，以樣品濃度為自變量，反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量，在兩種不同濃度的底物下，獲得兩條直線，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程，求出兩直線交點(diǎn)的X軸值，即得抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ki值。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用Eupatilin顯著抑制了尿酸的生成，明顯抑制了黃嘌呤氧化酶，表現(xiàn)為混合型抑制，并與濃度相關(guān)，與空白組對(duì)照差異性顯著，P＜0.01。見圖1。

圖1　Eupatilin對(duì)黃嘌呤氧化酶的Linweaver-Burk曲線

3.2各樣品對(duì)XO的抑制效果將各樣品濃度與平均抑制率進(jìn)行線形回歸，然后根據(jù)回歸方程計(jì)算抑制率I=50%時(shí)C的值，即為半數(shù)抑制濃度IC50。見表1。

表1　各樣品對(duì)XO的抑制效果

3.3抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ki值計(jì)算采用Dixon繪圖法計(jì)算Ki值：以樣品濃度為自變量，反應(yīng)速率的倒數(shù)為因變量，在兩種不同濃度的底物下，得到兩直線，再用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包計(jì)算回歸方程，求出兩直線交點(diǎn)的X軸值，即為抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ki。見圖2~圖3。

圖2　黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中Eupatilin的Dixon圖

圖3　黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中別嘌呤醇的Dixon圖

4　討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Eupatilin能有效抑制黃嘌呤氧化酶活性，且與濃度相關(guān)，表現(xiàn)為混合型抑制，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究打下了基礎(chǔ)。Eupatilin是中藥艾葉里提取的一種重要的黃酮類活性成分，具有治療胃潰瘍和鎮(zhèn)痙的作用[1~2]，在韓國已作為抗胃潰瘍藥上市，另外還具有調(diào)控血糖含量[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6~7]等功能。

近年來國內(nèi)外許多學(xué)者研究報(bào)道，一些植物化學(xué)成分對(duì)黃嘌呤氧化酶具有很強(qiáng)的抑制作用，F(xiàn)lemmig等[8]研究發(fā)現(xiàn)一種黃酮類化合物（flavone aglycone apigenin）和木犀草素（luteolin）等對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用明顯強(qiáng)于別嘌呤醇（其Ki值遠(yuǎn)低于別嘌呤醇）；Arimboor等[9]發(fā)現(xiàn)一種提取自印度植物種子中的黃酮類化合物（Tetrahydroamentoflavone）在黃嘌呤氧化酶抑制實(shí)驗(yàn)中也有著較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制作用，其IC50值為92 nM，Ki值為0.982 μM，與別嘌呤醇差距不大（別嘌呤醇IC50值為100nM，Ki值為0.612 μM）；Lin等[10]報(bào)道一種二萜類化合物（sugiol）對(duì)黃嘌呤氧化酶也有明顯的抑制作用，其IC50值為（6.8±0.4）μM。下一步我們將在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步嘗試通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究探索其對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用、藥代動(dòng)力學(xué)以及藥物安全性，希望能找到更安全有效的痛風(fēng)治療制劑。

參考文獻(xiàn)

[1]Seo HJ,Surh YJ.Eupatilin, a pharmacologically active flavone derived from Artemisia plants, induces apoptosis in human promyelocytic leukemia cells[J].Mutat Res,2001,496(1-2):191-198

[2]Kim SH,Lee SD,Kim WB,et al.Determination of a new antiulcer agent, eupatilin, in rat plasma, bile, urine, and liver homogenate by high-performance liquid chromatography [J].Res Commun Mol Pathol Pharmacol,1997,97(2):165-170

[3]Kang YJ,Jung UJ,Lee MK,et al.Eupatilin, isolated from Artemisia princeps Pampanini, enhances hepatic glucose metabolism and pancreatic beta-cell function in type2 diabetic mice [J].Diabetes Res Clin Pract,2008,82(1):25-32

[4]Choi EJ,Oh HM,Na BR,et al.Eupatilin protects gastric epithelial cells from oxidative damage and down-regulates genes responsible for the cellular oxidative stress[J].Pharm Res,2008,25(6):1355-1364

[5]Joo M,Kim HS,Kwon TH,et al.Anti-inflammatory Effects of Flavonoids on TNBS-induced Colitis of Rats [J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(1):43-50

[6]Park BB,Yoon JS,Kim ES,et al.Inhibitory effects of eupatilin on tumor invasion of human gastric cancer MKN-1 cells [J].Tumour Biol,2013,34(2):875-885

[7]Koshihara Y,Neichi T,Murota S,et a1.Selective inhibition of 5-lipoxygenase by natural compounds isolated from Chinese plants, Artemisia rubripes Nakai[J].FEBS Lett,l983,158(1):41-44

[8]Flemmig J,Kuchta K,Arnhold J,et al.Olea europaea leaf (Ph.Eur.) extract as well as several of its isolated phenolics inhibit the gout-related enzyme xanthine oxidase[J].Phytomedicine,2011,18(7): 561-566

[9]Arimboor R,Rangan M,Aravind SG,et al.Tetrahydroamentoflavone (THA) from Semecarpus anacardium as a potent inhibitor of xanthine oxidase[J].J Ethnopharmacol,2011,133(3):1117-1120

[10]Lin CN,Huang AM,Lin KW,et al.Xanthine oxidase inhibitory terpenoids of Amentotaxus formosana protect cisplatin-induced cell death by reducing reactive oxygen species (ROS) in normal human urothelial and bladder cancer cells [J].Phytochemistry,2010,71 (17-18):2140-2146

Study on Inhibitory Effect of Eupatilin on Xanthine Oxidase Activity

WANG Hai-dong1, XIE Jian-xiang2, LIN Wei-qing1#(1The People’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006; 2The Children’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006)

Abstract:Objective: To research the influence and inhibitory mechanism of Eupatilin on the activity of Xanthine Oxidase by vitro enzymatic test. Methods: Determined the absorbance changes caused by the formation of uric acid value by using UV spectrophotometer, the detection wavelength was 292 nm, according to the measured results, draw the Lineweaver Burk and Dixon plots with Xanthine as substrate. Results: Eupatilin had strong inhibition on Xanthine Oxidase, the Ki value was 0.128 6 μg/ml, the type of inhibition is of mixed type; and with Allopurinol as a reference, the Ki value was 0.62 μg/ml, the type of inhibition was competitive inhibition. Conclusion: Eupatilin has the obvious inhibitory activity of Xanthine Oxidase.

Key words:Eupatilin; Xanthine oxidase (XO); Xanthine; Inhibitory effect

收稿日期：（2015-03-23）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.054

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

中圖分類號(hào)：R285.5