響應(yīng)面法優(yōu)化三種天然產(chǎn)物 對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

趙守渙,楊 慧,史冠瑩,王曉敏,趙洪源,王趙改

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)是催化黃嘌呤和次黃嘌呤代謝產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶[1],體內(nèi)尿酸的產(chǎn)生隨XO活性升高而增多,進(jìn)而導(dǎo)致高尿酸血癥,統(tǒng)計表明5%～12%高尿酸血癥會發(fā)展成痛風(fēng)[2-3]。促進(jìn)尿酸排泄和抑制尿酸生成是治療痛風(fēng)的兩種手段,其中可通過抑制XO的活性減少尿酸生成,因此,黃嘌呤氧化酶是研發(fā)治療痛風(fēng)藥物的主要方向和靶點(diǎn)[4]。目前多從天然產(chǎn)物中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑[5-6]降低常用藥引起的毒副作用[7-8],為開發(fā)抗痛風(fēng)保健食品篩選優(yōu)良的原材料。已篩選出的多種具有較強(qiáng)抑制活性的單體化合物有傘形酮、槲皮素、白藜三醇等[9]。

張岑等[10]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素抑制了對黃嘌呤的催化活性,減少了尿酸的形成。沒食子酸是一種廣泛存在于大黃、山茱萸等植物中的多酚類化合物,孫永麗[11]利用HPLC法篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑,發(fā)現(xiàn)槲皮素、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和沒食子酸芍藥苷等具有較強(qiáng)的抑制活性。葛根素是由豆科植物野葛的根部提取,屬黃酮類物質(zhì),具有抗炎、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化、降血脂和抑制黃嘌呤氧化酶的作用[12]。本實驗研究三種黃酮類天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素實驗和響應(yīng)面實驗,確定槲皮素、葛根素和沒食子酸三種天然產(chǎn)物的最佳配比,提高天然產(chǎn)物抑制劑的效率,節(jié)約資源,為開發(fā)功能性食品提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黃嘌呤氧化酶 X1875-5UN,美國Sigma公司;黃嘌呤 純度≥95%,美國Sigma公司;槲皮素 純度≥95%,美國Sigma公司;沒食子酸 純度≥99%,天津市光復(fù)精細(xì)化工廠;葛根素 純度≥98%,Macklin公司;氫氧化鈉和磷酸二氫鉀 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SB-5200 DTD 超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;ME204E 型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;NUII-10T型實驗室(超)純水機(jī) 南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司;GENESYS 10S型UV-VIS紫外分光光度計 美國Thermo公司;BL-250 A型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市青松五金廠;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;H1650R/H1850R臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制 磷酸緩沖溶液(50 mmol/L,pH7.5)的配制:將205 mL 0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液與250 mL 0.2 mol/L的磷酸二氫鉀溶液混合,定容至1000 mL,4 ℃保存?zhèn)溆?黃嘌呤溶液的配制:稱取30 mg黃嘌呤加入2 mL氨水,超聲溶解,加磷酸鉀緩沖液定容配溶液制成1 mmol/L的溶液,用時稀釋10倍,即為0.1 mmol/L的黃嘌呤應(yīng)用液。黃嘌呤氧化酶溶液配制:取500 U黃嘌呤氧化酶于10 mL容量瓶溶解并定容,配制成50 U/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 抑制劑對黃嘌呤氧化酶抑制能力的測定 參考史珅等[13]的方法,略作修改,具體如下:以黃嘌呤為反應(yīng)底物,根據(jù)反應(yīng)生成的尿酸在290 nm有明顯的特征吸收峰,根據(jù)尿酸的生成量,反應(yīng)黃嘌呤氧化酶的活性。實驗各組物質(zhì)加入量如表1所示。

表1 黃嘌呤氧化酶酶活測定Table 1 Determination of the activity of xanthine oxidase

向5 mL試管中依次加入pH為7.5,50 mmol/L的磷酸緩沖液、不同濃度的待測物、黃嘌呤氧化酶(50 U/mL)和黃嘌呤溶液(0.1 mmol/L)后25 ℃反應(yīng)30 min,于290 nm處測定各組OD值。沒食子酸、葛根素和槲皮素母液濃度均為1 mg/L,梯度稀釋進(jìn)行測定。按照下式(1)計算不同濃度水提物對黃嘌呤氧化酶的抑制率。通過待測物濃度與酶活抑制率的關(guān)系曲線圖,利用SPSS軟件計算三種待測物對黃嘌呤氧化酶酶活抑制的IC50。

式(1)

式中,Ai為樣品實驗組的抑制率;Aj為樣品空白組的抑制率;A0為對照實驗組的抑制率;A1為對照空白組的抑制率。

1.2.3 抑制劑對黃嘌呤氧化酶抑制類型判斷 在酶促反應(yīng)體系中,加入一定劑量的抑制劑,測定不同濃度的酶溶液對反應(yīng)速率的影響,以酶濃度為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖,得出相關(guān)性曲線,確定抑制劑對酶的抑制是否可逆,即反應(yīng)類型。參考Yang X等[14]的方法,略作修改,具體如下:分別測定了槲皮素濃度為0、5、10和20 μg/mL時,沒食子酸濃度為0、25、50和100 μg/mL時,葛根素濃度為0、50、100和200 μg/mL時酶溶液下的反應(yīng)速率,繪制曲線,判斷反應(yīng)類型。

1.2.4 單因素實驗 根據(jù)1.2.2的實驗結(jié)果,固定沒食子酸濃度333 μg/mL、葛根素濃度1000 μg/mL,探討槲皮素濃度(0.00、33.75、67.50、125.00、250.00、500.00 μg/mL)對黃嘌呤氧化酶抑制作用的影響;固定槲皮素濃度125 μg/mL、葛根素濃度1000 μg/mL,探討沒食子酸濃度(0.00、83.25、166.50、333.00、666.00、1332.00 μg/mL)對黃嘌呤氧化酶抑制作用的影響;固定槲皮素濃度125 μg/mL、沒食子酸濃度333 μg/mL,探討葛根素濃度(0.00、250.00、500.00、1000.00、2000.00、4000.00 μg/mL)對黃嘌呤氧化酶抑制作用的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取三種水提物的濃度為自變量,以對黃嘌呤氧化酶的抑制率為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行實驗設(shè)計,實驗因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 2 Factors and levels in response sueface design

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 8.5軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶抑制的IC50值

IC50是評價待測物對黃嘌呤氧化酶抑制力的重要指標(biāo),可作為篩選抑制劑的手段。由表3可知，槲皮素、沒食子酸和葛根素對黃嘌呤氧化酶抑制的IC50值分別為44.86、183.61和555.20 μg/mL,抑制效果:槲皮素>沒食子酸>葛根素。申啟榮[15]從中草藥活性單體,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用優(yōu)于葛根素,其中槲皮素的IC50值為11.09 μg/mL,葛根素濃度為60 μg/mL時抑制率約為20%。馬文濤[16]測定了30種黃酮單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有較好的抑制作用,且效果優(yōu)于葛根素,與本文結(jié)果一致。

表3 滿足95%置信區(qū)間的三種天然產(chǎn)物對酶抑制的IC50Table 3 The IC50 of the three natural products that meet the 95% confidence interval for inhibition of enzyme activity

2.2 抑制劑對黃嘌呤氧化酶的抑制作用類型分析

由圖1可知,這些直線都經(jīng)過原點(diǎn),且隨抑制劑濃度的增加,直線的斜率不斷降低,說明三種天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用是可逆的。三種抑制劑以非共價鍵與酶分子可逆性結(jié)合造成酶活性的抑制,當(dāng)反應(yīng)體系中抑制劑濃度降低時,結(jié)合所成的復(fù)合物又復(fù)解離。

圖1 三種天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Fig.1 Effect of inhibitory rate on xanthine oxidase 注：(a)槲皮素;(b)沒食子酸;(c)葛根素。

2.3 三種天然產(chǎn)物的單因素實驗

2.3.1 槲皮素對黃嘌呤氧化酶抑制率影響的單因素分析 從圖2可以看出,隨著槲皮素濃度的不斷增大,其對黃嘌呤氧化酶的抑制作用先增強(qiáng)隨后趨于平緩。當(dāng)槲皮素濃度在33.75 μg/mL以下時,此時酶促反應(yīng)處于一級反應(yīng)階段,抑制率與抑制劑濃度處于直線上升的階段;當(dāng)槲皮素濃度在33.75～125.00 μg/mL范圍內(nèi)上升時,此時酶促反應(yīng)處于混合反應(yīng)階段;當(dāng)槲皮素濃度從125.00 μg/mL繼續(xù)上升時,此時酶促反應(yīng)處于零級反應(yīng)階段,三種天然產(chǎn)物幾乎抑制了全部的酶活性,抑制率不再隨著抑制劑濃度的增大而上升,趨于平緩。在一定濃度范圍內(nèi),三種天然產(chǎn)物得以互補(bǔ),協(xié)同增效,不僅減少了天然產(chǎn)物的用量,而且具有更好的抗性效果[17]。選擇33.75～125.00 μg/mL為槲皮素最適濃度

圖2 不同濃度的槲皮素溶液對黃嘌呤氧化酶抑制率影響Fig.2 Effects of different concentrations of quercetin on xanthine oxidase inhibitory rate

2.3.2 沒食子酸對黃嘌呤氧化酶抑制率影響的單因素分析 從圖3可以看出,隨著沒食子酸濃度的不斷增大,其對黃嘌呤氧化酶的抑制作用不斷增強(qiáng)。當(dāng)沒食子酸濃度在83.25 μg/mL以下時,抑制率與抑制劑濃度處于直線上升的階段;當(dāng)沒食子酸濃度在83.25～1332.00 μg/mL范圍內(nèi)上升時,此時酶促反應(yīng)處于混合反應(yīng)階段,由于只有少數(shù)酶具有活性,抑制率與抑制劑濃度呈現(xiàn)緩慢上升的關(guān)系。選擇選擇83.25～333.00 μg/mL為沒食子酸最適濃度。

圖3 不同濃度的沒食子酸對黃嘌呤氧化酶抑制率影響Fig.3 Effects of different concentrations of gallic acid on xanthine oxidase inhibitory rate

2.3.3 葛根素對黃嘌呤氧化酶抑制率影響的單因素分析 從圖4可以看出,隨著葛根素濃度的不斷增大,其對黃嘌呤氧化酶的抑制作用先增強(qiáng)隨后趨于平緩。當(dāng)葛根素濃度在500.00 μg/mL以下時,此時酶促反應(yīng)處于一級反應(yīng)階段,抑制率與抑制劑濃度處于直線上升的階段。當(dāng)葛根素濃度大于1000.00 μg/mL時,大部分酶活被三種天然產(chǎn)物抑制,只有少數(shù)酶具有活性,抑制率緩慢上升。選擇250.00～1000.00 μg/mL為葛根素最適濃度。

圖4 不同濃度的葛根素對黃嘌呤氧化酶抑制率影響Fig.4 Effects of different concentrations of puerarin on xanthine oxidase rate

2.4 三種天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶酶活抑制率的響應(yīng)面分析

2.4.1 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件設(shè)計出的結(jié)果方案及實驗結(jié)果如表4所示,以對黃嘌呤氧化酶的抑制率為響應(yīng)值,以槲皮素(A)、沒食子酸(B)和葛根素(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設(shè)計共包括17個實驗方案,其中12個析因?qū)嶒烖c(diǎn),5個中心實驗點(diǎn),用以計算實驗誤差。

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 RSM design and inhibitory rate

2.4.2 回歸方程擬合及方差分析 本實驗利用Design-Expert 8.0.6軟件對表的實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析,響應(yīng)值用Y表示,得到了二次多項式的回歸方程:

Y=96.57+1.82A+0.61B+0.52C+0.27AB+0.14AC+2.14BC-2.59A2-3.24B2-0.66C2

該回歸模型的方差分析見表5,該模型的F=124.33,p<0.0001,說明該模型與實際擬合良好,實驗方法可靠。同時失擬項不顯著(p>0.05),模型的決定系數(shù)R2為0.9938,校正后的決定系數(shù)為0.9858,說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小,可以用于槲皮素、沒食子酸和葛根素復(fù)配溶液抑制黃嘌呤氧化酶的分析及預(yù)測。且由表中可以看出一次項A、B、C的p值均小于0.01,表明槲皮素、沒食子酸和葛根素對黃嘌呤氧化酶的抑制具有極顯著影響;交互項BC的p值小于0.01,

表5 回歸模型及方差分析 Table 5 Analysis of variance of regression equation

AB、AC的p值均大于0.05,說明沒食子酸與葛根素的交互作用對黃嘌呤氧化酶的抑制具有極顯著影響,槲皮素與沒食子酸及槲皮素與葛根素的交互作用不顯著。影響槲皮素、沒食子酸和葛根素抑制黃嘌呤氧化酶的3個因素的主次因素依次為:槲皮素>沒食子酸>葛根素。

2.4.3 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面法是優(yōu)化存在多因素影響實驗條件的方法,通過固定數(shù)量的實驗次數(shù)可以連續(xù)的對實驗因素進(jìn)行分析,得到直觀的3D曲面圖進(jìn)而評價各因素間的交互作用[18]。如圖5所示為當(dāng)固定槲皮素(A)、沒食子酸(B)、葛根素(C)中任意兩個因素為零水平時,其余兩個因素間的交互作用及對對黃嘌呤氧化酶抑制率影響。抑制率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢,達(dá)到一定值時,曲面稍微下降或趨于平緩。結(jié)果如圖5(a～f)所示,其中圖5(e)和(f)為固定槲皮素濃度為零水平,沒食子酸和葛根素濃度對抑制率的影響和兩者之間的交互作用。且曲面陡峭,說明沒食子酸和葛根素之間交互作用顯著,與方差分析結(jié)果相符。沒食子酸濃度較低時,抑制率隨葛根素濃度的增加而變大,隨后趨于平緩。綜上所述,沒食子酸上升的幅度較葛根素稍陡峭,說明沒食子酸濃度對抑制率影響稍大。通過軟件最后結(jié)果分析,得到的抑制黃嘌呤氧化酶的最佳復(fù)配濃度為:槲皮素83.36 μg/mL;沒食子酸166.50 μg/mL;葛根素647.50 μg/mL,此時對黃嘌呤氧化酶的預(yù)測抑制率為96.97%。

圖5 兩因素的交互作用對黃嘌呤氧化酶抑制率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the inhibitory rate of xanthine oxidase

2.4.4 驗證實驗 為方便實際操作將實驗條件定為:槲皮素83.25 μg/mL,沒食子酸166.50 μg/mL,葛根素650.00 μg/mL,該條件下的5次實驗平均抑制率為96.92%±0.17%。與模型計算出的抑制率極為接近,說明該響應(yīng)面模型可靠,此法可有效優(yōu)化抗痛風(fēng)復(fù)配工藝。

3 結(jié)論

槲皮素、沒食子酸和葛根素溶液對黃嘌呤氧化酶抑制的IC50分別為44.86、183.61和555.20 μg/mL,抑制效果為:槲皮素>沒食子酸>葛根素,且均為可逆反應(yīng)。響應(yīng)面所建立的回歸模型具有可靠性,優(yōu)化的抑制黃嘌呤氧化酶的最佳復(fù)配濃度為:槲皮素83.25 μg/mL,沒食子酸166.50 μg/mL,葛根素650.00 μg/mL,對黃嘌呤氧化酶抑制率為96.92%±0.17%,與模型預(yù)測抑制率96.97%極為接近。天然產(chǎn)物經(jīng)復(fù)配產(chǎn)生相互促進(jìn)的作用,提高對酶的抑制力,為篩選高效的酶抑制劑提供一種行之有效的方法。

[1]Enroth C,Eger B T,Okamoto K,et al. Crystal structures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:structure-based mechanism of conversion[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(20):10723.

[2]劉佳,李玲. 高尿酸血癥的發(fā)病機(jī)制與藥物治療研究進(jìn)展[J]. 國際藥學(xué)研究雜志,2010,37(1):24-28.

[3]Smith E U R,Diaz-TornE C,Perez-Ruiz F,et al. Epidemiology of gout:An update[J]. Best Practice & Research Clinical Rheumatology,2010,24(6):811-811.

[4]劉永貴,趙麗嘉,崔艷麗,等. 抗高尿酸血癥藥物研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2015,30(3):345-350.

[5]許洪波,周瑞,謝培,等. 27種中草藥的黃嘌呤氧化酶抑制活性篩選[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2017,28(3):547-548.

[6]楊道茂,歐陽明安. 9種中藥提取物黃嘌呤氧化酶抑制活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(578):597-600.

[7]Khanna D. American College of Rheumatology guidelines for management of gout[J]. Uric Acid Research,2013,37(2):45-47.

[8]中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會. 高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的中國專家共識[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志,2013,29(11):913-920.

[9]Zhao H,Wang X,Li W,et al. A new minor homoiso flavonoid from Caesalpinia sappan[J]. Natural Product Research,2014,28(2):102.

[10]張岑,張國文. 光譜學(xué)結(jié)合分子模擬技術(shù)研究槲皮素對黃嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析,2016,36(10):349-350.

[11]孫永麗. 體外篩選具黃嘌呤氧化酶抑制活性的天然產(chǎn)物[D]. 濟(jì)南:濟(jì)南大學(xué),2015.

[12]尹樂斌,夏秋良,趙良忠,等. 葛根藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2016,15(4):68-69.

[13]史珅,常偉,尚小玉,等. 幾種天然產(chǎn)物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用[J]. 中國食品學(xué)報,2014,14(7):138-143.

[14]Yang X,Kong F. Evaluation of theinvitroα-glucosidase inhibitory activity of green tea polyphenols and different tea types[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2015,96(3):777-782.

[15]申啟榮. 中藥黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選及抑制動力學(xué)研究[D]. 南昌:南昌大學(xué),2015.

[16]馬文濤. 黃嘌呤氧化酶、脂氧化酶和環(huán)氧化酶抑制劑的篩選及其體外抗腫瘤活性研究[D]. 武漢:湖北中醫(yī)藥大學(xué),2016.

[17]王婷婷,牛黎莉,張珍,等. 四種變性淀粉與黃原膠和魔芋膠復(fù)配體系粘度特性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,(23):63-67.

[18]Wang X,Wu Y,Chen G,et al. Optimization of ultrasound assisted extraction of phenolic compounds from Sparganii rhizoma,with response surface methodology[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2013,20(3):846-854.

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