qPCR快速定量檢測泡結(jié)球甘藍 發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌的數(shù)量變化

汪冬冬,宋亞誼,陳 功,3,李 恒,3,申文熹,伍亞龍, 王 勇,唐 垚,章宇丹,張 偉,朱 翔,張其圣,3,*

(1.四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,四川眉山 620000;2.四川大學(xué)錦江學(xué)院,四川眉山 620860； 3.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院,四川溫江 611130)

泡菜是中國典型傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵制品,其發(fā)酵過程中微生物體系龐大且復(fù)雜。探明泡菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演變與動態(tài)變化規(guī)律,有利于了解并掌控泡菜的發(fā)酵過程,進而保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全性。楊瑞等發(fā)現(xiàn)泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌處于優(yōu)勢地位并抑制發(fā)酵初期中占優(yōu)勢的大腸埃希氏菌等雜菌生長[1]。盛海圓等研究表明泡菜中乳桿菌屬占主要優(yōu)勢,其次為腸球菌屬、葡萄球菌屬和片球菌屬,其中乳桿菌中植物乳桿菌占明顯優(yōu)勢[2]。張先琴等研究表明在泡菜細菌中乳桿菌屬是優(yōu)勢種群，占總數(shù)的56%[3]。趙永威等研究結(jié)果顯示腌制冬瓜發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌有乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和葡萄球菌屬等[4]。現(xiàn)有報道的泡菜發(fā)酵乳酸菌包括10余個屬100多個種[5],而乳桿菌屬,尤其是植物乳桿菌是廣泛報道的主導(dǎo)泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢微生物[6]。泡菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物的生長是一個動態(tài)變化的過程,采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法,費時、費力,而且由于培養(yǎng)基的選擇性以及不可培養(yǎng)微生物的影響,無法快速準確地反映泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落構(gòu)成及動態(tài)變化;而采用免培養(yǎng)方法如PCR-DGGE和高通量測序,耗時長、費用高、只能反映相對構(gòu)成。

近年來,qPCR技術(shù),即實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品微生物的快速檢測,此方法可以目的明確、快速、準確計量發(fā)酵體系中特定微生物,在發(fā)酵蔬菜和發(fā)酵橄欖中也有一些應(yīng)用[7-8]。石慧等采用qPCR結(jié)合DNA染料的方法,建立了快速檢測泡菜中乳酸菌活菌的EMA-qPCR法[9]。孟霞等采用18S rDNA克隆文庫結(jié)合ARDRA分型分析對青菜泡菜發(fā)酵過程真菌的多樣性進行研究,并采用qPCR方法對其進行驗證,兩種方法結(jié)果基本吻合[10]。魏娜等通過qPCR技術(shù),定量分析不同窖齡窖泥中的古菌、總細菌和群瘤胃菌、乳桿菌和毛螺旋菌三種優(yōu)勢菌群[11]。周曉紅等采用qPCR方法檢測沙門菌、志賀菌等食源性致病菌[12]。

為快速定量監(jiān)控泡菜發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌的動態(tài)變化,本實驗建立了利用qPCR技術(shù)快速檢測植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的方法,以期為泡菜發(fā)酵質(zhì)量的快速判定以及深入了解、控制泡菜發(fā)酵過程提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

結(jié)球甘藍、食鹽 眉山某超市;2xSG Fast qPCR Master Mix 上海生工生物;Bacterial DNA Isolation Kit、Taq PCR Master Mix 成都福際生物;PCR引物 成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司;DNase/RNase-Free Deionized Water 北京天根生化;BHI培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、無水乙醇 眉山和通化工;目標(biāo)菌株由四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院提供(見表1)。

表1 目標(biāo)菌及其qPCR擴增引物Table 1 Dominant bacteria and qPCR amplification primers

高速離心機 Thermo Scientific;單人單面凈化工作臺 蘇凈凈化有限公司;T960PCR儀 杭州晶格有限公司;DYY-8C電泳儀 北京六一有限公司;JY04S-3E凝膠成像儀 君意東方有限公司;實時熒光PCR儀 Bio-Rad;立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申有限公司;JD200-3電子天平 龍騰電子有限公司;DHP-9270B電熱恒溫培養(yǎng)箱 上?，槴\有限公司;HH-4恒溫水浴鍋 江蘇澳華儀器有限公司;電子萬用爐 北京永光明有限公司;QL-901旋渦混合器 江蘇其林貝爾有限公司;Mini-6K低速離心機 杭州奧盛有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜制作及取樣 將泡菜壇和新鮮結(jié)球甘藍清洗干凈,結(jié)球甘藍切好備用,稱取700 g切好的結(jié)球甘藍放入泡菜壇中,加入備好的純凈水1400 mL,加入42 g食鹽,25 ℃恒溫發(fā)酵;同時泡制兩壇泡菜。分別于0、1、2、3、5、7、10 d取泡菜發(fā)酵液進行分析,每次取樣5 mL,置于-20 ℃密封保存。取樣時先將泡菜輕輕搖勻,取周邊4 個點和中間2 個樣進行混合。

1.2.2 樣品總DNA提取 采用試劑盒(Bacterial DNA Isolation Kit)方法提取泡菜發(fā)酵液樣品的DNA,-20 ℃密封保存。具體操作步驟如下:在1.5 mL離心管中加入1.5 mL樣品,12000 r/min室溫離心1 min,吸盡上清液,向離心管中加入0.16 mL Buffer EB,重懸菌體;再加入40 μL溶菌酶(50 mg/mL),漩渦混勻,37 ℃放置30 min;7200 r/min離心3 min,除去上清液。向沉淀中加入380 μL Buffer ML1,旋渦震蕩使菌體徹底懸浮;加入20 μL Foregene Protease,旋渦混勻;將離心管于65 ℃水浴30 min,并每隔10 min漩渦混勻一次;加入380 μL Buffer ML2,顛倒混勻,65 ℃水浴10 min;12000 r/min離心10 min。吸取750 μL上清至新離心管,加入150 μL無水乙醇,劇烈震蕩至充分混勻。將混合液移至離心柱,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液。向離心柱中加入500 μL Buffer PW,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液。向離心柱中加入700 μL Buffer WB,12000 r/min離心1 min,棄掉收集管中廢液,并重復(fù)操作一次。12000 r/min空管離心2 min,將離心柱移至新的1.5 mL離心管中,向膜中央懸滴100 μL已65 ℃預(yù)熱的Buffer EB,室溫放置5 min,12000 r/min離心1 min。將離心管中洗脫液移回至離心柱,12000 r/min離心1 min,收集洗脫液。

1.2.3 標(biāo)準質(zhì)粒制備 分別將菌株12CR5在MRS培養(yǎng)基中,3Z8D25和1S5D25在PCA培養(yǎng)基中、0R3在BHI培養(yǎng)基中活化后,采用試劑盒方法提取純化DNA。再進行細菌16S rDNA序列PCR擴增,擴增引物為27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT),擴增體系(50 μL):2×PCR Mix 25 μL、模板DNA 1.5 μL、引物27F(10 μmol/L)和1492R(10 μmol/L)各2 μL,加雙重蒸餾水補充至50 μL;擴增程序:95 ℃預(yù)變性10 min;93 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35次循環(huán);72 ℃延伸10 min。用2.0%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物(大小約1500 bp)進行電泳檢測,將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行標(biāo)準質(zhì)粒制備,質(zhì)?？截悵舛菴/(copy/mL)計算公式[17]:

C=[DNA amount(g/mL)×6.02×1023(copy/mole)]/[DNA length(bp)×660(g/mole/bp)]

1.2.4 qPCR擴增 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR擴增體系見表2,擴增程序見表3:

表2 qPCR反應(yīng)體系Table 2 qPCR reaction system

1.2.5 標(biāo)準曲線的建立 將標(biāo)準質(zhì)粒依次10倍稀釋得1012～106copies/mL的梯度濃度,將其作為DNA模板進行qPCR擴增,反應(yīng)體系及擴增程序見1.2.4中表2和表3。每種標(biāo)準質(zhì)粒做兩組平行樣,每組模板梯度加入一個空白對照,取其平均值,以標(biāo)準質(zhì)粒初始拷貝濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo),相應(yīng)的CT值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準曲線,并計算其擴增效率E。

計算公式[18]:E(%)=(10-1/slope-1)×100

1.2.6 熔解曲線制作 1.2.4擴增程序中40個循環(huán)結(jié)束后,從65 ℃每5 s升高0.5 ℃直至95 ℃,此中每階段采集熒光信號,最后以溫度為橫坐標(biāo),熒光值變化速度為縱坐標(biāo)繪制熔解曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excle繪制標(biāo)準曲線,計算測定結(jié)果,Originpro 8.6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準曲線的構(gòu)建

標(biāo)準質(zhì)粒線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、擴增效率見表4,110%≥擴增效率(E)≥90%,R2≥0.98,均符合qPCR檢測基本要求[18-19]。同時樣品中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的CT值均在相應(yīng)標(biāo)準曲線測定質(zhì)粒濃度范圍內(nèi),表明其測定結(jié)果準確可靠。

表4 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR標(biāo)準曲線相關(guān)表Table 4 Standard curve for quantification of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli

2.2 回收率分析

目標(biāo)菌回收率和標(biāo)準質(zhì)粒、樣品、加標(biāo)樣品濃度如表5所示。各目標(biāo)菌標(biāo)準質(zhì)?；厥章示?0%～100%范圍內(nèi),表明1.2.2中DNA提取純化方法具有較高準確性,可用于對泡菜液樣品進行處理。

表5 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR的加標(biāo)回收率檢測Table 5 Standard Recovery of qPCR of the Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli

2.3 熔解曲線分析

熔解曲線見圖1，植物乳桿菌在82.5 ℃、芽孢桿菌屬在88.5 ℃、葡萄球菌屬在87 ℃、大腸埃希氏菌在87 ℃出現(xiàn)僅有的單峰,說明擴增過程中沒有引物二聚體和非特異產(chǎn)物生成,擴增效果特異性強。

圖1 植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌qPCR熔解曲線Fig.1 Melting curves of qPCR of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli 注：A：植物乳桿菌；B：芽孢桿菌屬；C：葡萄球菌屬；D：大腸埃希氏菌，圖2同。

2.4 泡結(jié)球甘藍發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌的qPCR分析

綜上所述,此次實驗建立的qPCR檢測方法準確可靠,可用于對泡菜液樣品植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的定量檢測。采用此方法檢測泡菜發(fā)酵過程中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的變化規(guī)律,結(jié)果如圖2所示。

圖2 泡菜液中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化Fig.2 Gene copy number change of Lactobacillus plantarum,Bacillus,Staphylococcus and Escherichia coli during the fermentation process of pickled cabbage

如圖2所示,泡菜在自然發(fā)酵過程中,植物乳桿菌和芽孢桿菌屬基因拷貝數(shù)在前期呈上升趨勢,分別在5 d達到峰值(4.14±0.38)×109copies/mL和在3 d達到峰值(7.64±2.42)×109,隨后其基因拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在這個數(shù)量級;葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化趨勢基本一致,均為前期上升達到峰值后穩(wěn)步下降;葡萄球菌屬在3 d達到峰值(2.62±0.21)×105copies/mL;大腸埃希氏菌在5 d達到峰值(2.93±0.84)×1012copies/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了泡菜中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌的qPCR快速定量檢測方法,并將其應(yīng)用到泡菜樣品的檢測中,標(biāo)準曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.98,擴增效率90%≤E≤110%,樣品加標(biāo)回收率在80%～100%的范圍內(nèi),符合qPCR基本檢測要求;熔解曲線僅出現(xiàn)單峰,擴增特異性強,無非特異性產(chǎn)物生成。采用此方法對泡白菜自然發(fā)酵過程中植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌進行定量檢測,實驗結(jié)果顯示泡菜液中植物乳桿菌和芽孢桿菌屬基因拷貝數(shù)在前期呈上升趨勢,分別在5 d達到峰值(4.14±0.38)×109copies/mL和在3 d達到峰值(7.64±2.42)×109,隨后其基因拷貝數(shù)一直穩(wěn)定在這個數(shù)量級;葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌基因拷貝數(shù)變化趨勢基本一致,均為前期上升達到峰值后穩(wěn)步下降;葡萄球菌屬在3 d達到峰值(2.62±0.21)×105copies/mL;大腸埃希氏菌在5 d達到峰值(2.93±0.84)×1012copies/mL。在泡菜發(fā)酵前期大腸埃希氏菌處于優(yōu)勢地位,隨著發(fā)酵的進行植物乳桿菌和芽孢桿菌屬數(shù)量漸漸增長,是發(fā)酵中后期的優(yōu)勢菌;葡萄球菌在泡菜發(fā)酵各過程中含量相對較低。

在不同細菌細胞中16S rDNA基因片段拷貝數(shù)一般為1～15個[22],取其中間值7.5個/細胞,可大致計算出本研究樣品中細菌數(shù)量。關(guān)于自然發(fā)酵泡菜中微生物動態(tài)變化現(xiàn)已有大量實驗報道,多利用平板計數(shù)法進行微生物數(shù)量檢測,本實驗所得結(jié)果與文獻中通過傳統(tǒng)方法檢測的泡菜自然發(fā)酵結(jié)果[23-34]相對比,植物乳桿菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌在自然發(fā)酵泡菜中動態(tài)變化趨勢相符合,但峰值出現(xiàn)時間滯后,且所得計數(shù)結(jié)果比傳統(tǒng)活菌計數(shù)高?？赡苁且驗閝PCR是通過檢測DNA拷貝濃度來計數(shù)細菌數(shù)量,沒有區(qū)分活菌或死菌,而傳統(tǒng)平板計數(shù)法只針對活菌進行計數(shù);泡菜發(fā)酵過程中,微生物死亡后還未被分解的DNA,在qPCR檢測中與熒光染料相結(jié)合產(chǎn)生熒光信號從而被定量,因此導(dǎo)致實驗結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)果相比較存在一定的差異。故下一步研究內(nèi)容將圍繞如何優(yōu)化此方法縮小上述差異開展。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法,如平板計數(shù)法人為操作誤差大,靈敏度低,用時長、培養(yǎng)基選擇性和不可培養(yǎng)微生物局限的影響,自然環(huán)境中可培養(yǎng)微生物僅占環(huán)境中微生物總數(shù)的0.1%～1%[35];PCR-DGGE和高通量測序等免培養(yǎng)方法耗時長、費用高、只能進行相對定量。利用qPCR技術(shù)對泡菜發(fā)酵過程中微生物進行分子層面的定量檢測,則克服了這些弊端,可以更快速準確地定量檢測泡菜中微生物,對其發(fā)酵過程進行更好的跟蹤監(jiān)控,為泡菜發(fā)酵質(zhì)量的快速判定以及深入了解、控制泡菜發(fā)酵過程奠定基礎(chǔ)。

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