桑寄生不同提取部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的體外抑制活性

梁 圓 蔡毅朱意麟盧小慧鐘夏瑜黎理

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧530200； 2.玉林市第一人民醫(yī)院， 廣西 玉林537099； 3.成都中醫(yī)藥大學(xué)， 四川 成都611137）

痛風(fēng)是人體嘌呤代謝異常所致的一組綜合癥，由尿酸鹽晶體聚積關(guān)節(jié)而引起［1］?，F(xiàn)治療痛風(fēng)多以黃嘌呤氧化酶為切入點(diǎn)，該酶為尿酸生成的關(guān)鍵代謝酶。長(zhǎng)期服用別嘌醇可能會(huì)引起過(guò)敏、肝腎損傷及骨髓抑制等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。中醫(yī)認(rèn)為“痛風(fēng)”屬于痹證或者痹病的范疇［2］，由于風(fēng)寒濕邪、風(fēng)濕熱邪痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，或者是由于痰濁、瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)所導(dǎo)致的，應(yīng)及時(shí)采用祛風(fēng)濕藥來(lái)祛風(fēng)通絡(luò)、祛邪外出。同時(shí)因中藥具有毒副作用低、多靶點(diǎn)、多組分的特點(diǎn)，適合以此尋找治療痛風(fēng)的天然活性物質(zhì)。

桑寄生為桑寄生科桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser 的干燥帶葉莖枝［3?4］。桑寄生及其配伍復(fù)方對(duì)于治療肝腎氣血不足、不榮所致疼痛或外感風(fēng)寒濕熱等邪氣所致的腰痛、痹證等肢體經(jīng)絡(luò)系常見病證具有良好的療效，還具有提高軟骨活力的作用［5?6］。同科植物紅花寄生的提取物能一定程度緩解由尿酸鈉所導(dǎo)致的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，但對(duì)于桑寄生治療痛風(fēng)相關(guān)疾病的研究尚未見報(bào)道［7］。本研究采用紫外分光光度法結(jié)合高效液相色譜法以考察不同寄主的桑寄生藥材不同提取部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的體外抑制作用，為擴(kuò)大桑寄生藥用價(jià)值提供參考。

1 材料

桑寄生，共13 批藥材，以桑樹為寄主的藥材分別采自廣西梧州市安平鎮(zhèn)富寧村、南寧市興寧區(qū)藥用植物園、河池市天蛾縣、玉林市興業(yè)縣石南鎮(zhèn)；以楓香樹、黃皮樹、大葉冬青樹、山楂樹和龍眼樹為寄主的藥材采自梧州市安平鎮(zhèn)；以桃樹和桂花樹為寄主的藥材采自南寧市西鄉(xiāng)塘；以樟樹為寄主的藥材采自廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院；以松樹為寄主的藥材采自百色市樂業(yè)縣，自然陰干，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔡毅教授鑒定為桑寄生科鈍果寄生屬植物桑寄生Taxillus chinensis（DC.）Danser 的干燥帶葉莖枝。

磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)20 201201；黃嘌呤、尿酸、別嘌醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)分別為E2008048、H1710084、L2 001123；二甲基亞楓（DMSO）、黃嘌呤氧化酶（XO），北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為1121E0316、227U013；磷酸二氫鉀試劑為色譜純；氫氧化鈉、鹽酸、石油醚（60～90 ℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇等試劑均為分析純；水為純水。

ES2220M 型電子天平，瑞士普利賽斯公司；5810R 型冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；HWS?26型恒溫水浴鍋、ALPHA1?2LD plus 型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)博勵(lì)行公司；UV?2600 型可見光紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；e2695 型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 提取物 取各批次桑寄生藥材（葉、枝為2∶1），打粉，加入10、8、6 倍量60% 乙醇，各回流提取2 h，合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，溶于熱水中，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇分別進(jìn)行萃取，得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各部位減壓濃縮、冷凍干燥，得到粉末，在陰涼處保存。

2.1.2 供試品 精密稱取桑寄生各提取部位粉末適量，加入PBS（含1% DMSO），超聲溶解，得4 000 μg／mL 溶液，用含1% DMSO 的PBS 進(jìn)行稀釋，得4 000、2 000、1 000、500、250、125 μg／mL的供試品。

2.1.3 酶溶液 取5 U／460 μL 的黃嘌呤氧化酶溶液適量，加入純水稀釋，得10、12.5、25、50、100、150、200、250、300 U／L 酶溶液，分裝至EP 管中，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 黃嘌呤底物溶液 精密稱取黃嘌呤粉末適量，置于50 mL 量瓶中，加入1 mol／L 氫氧化鈉適量，超聲溶解，最后加入純水定容至刻度線，得到1.2 mmol／L 底物貯備液，分裝至EP 管中，于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 尿酸溶液 精密稱取尿酸粉末適量，置于25 mL 量瓶中，加入少量PBS，超聲溶解，得0.59 mmol／L尿酸對(duì)照品溶液。

2.2 反應(yīng)體系建立

2.2.1 紫外反應(yīng)體系 設(shè)定總反應(yīng)體系為5 mL。樣品組加入各供試品0.2 mL、PBS 2.3 mL、黃嘌呤溶液2.0 mL、黃嘌呤氧化酶溶液0.5 mL以啟動(dòng)反應(yīng)；以不加黃嘌呤氧化酶溶液作為空白組；以不加供試品溶液為陽(yáng)性對(duì)照組；以不加供試品和黃嘌呤氧化酶溶液作為陰性對(duì)照組［8］。

2.2.2 高效液相反應(yīng)體系 流動(dòng)相為含1% 甲醇的0.02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液；洗脫時(shí)間15 min；體積流量1.0 mL／min；柱 溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL。樣品組加入各供試品0.2 mL、PBS 1.3 mL、黃嘌呤溶液2.0 mL、黃嘌呤氧化酶溶液0.5 mL 以啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)30 min 后加入1 mol／L鹽酸中止反應(yīng)；以不加黃嘌呤氧化酶溶液作為空白組；以不加供試品溶液為陽(yáng)性對(duì)照組；以不加供試品和黃嘌呤氧化酶溶液作為陰性對(duì)照組［9］。

2.3 酶活力測(cè)定 在“2.2.1”項(xiàng)紫外反應(yīng)體系中，向試管中加入2.5 mL PBS溶液、2 mL 1.2 mmol／L黃嘌呤溶液，將試管置于25 ℃水浴20 min，加入0.5 mL 50 U／L 黃嘌呤氧化酶溶液，混勻，迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中，于紫外分光光度計(jì)在200～800 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，確定尿酸產(chǎn)物特征吸收波長(zhǎng)。在同一反應(yīng)體系中，加入0.5 mL 不同濃度的黃嘌呤氧化酶溶液（10、12.5、25、50、100、150、200、250、300 U／L）以啟動(dòng)反應(yīng)，酶加入的時(shí)間為0 s，每隔1 s 測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定10 min，平行測(cè)定3 次。單位時(shí)間內(nèi)吸光度增長(zhǎng)越大，說(shuō)明酶的活性越高，以此篩選酶最佳反應(yīng)濃度。

2.4 反應(yīng)速率測(cè)定 在“2.2.1”項(xiàng)紫外反應(yīng)體系中，取各供試品（160、80、40、20、10 μg／mL）、2.3 mL PBS 溶液，2 mL 黃嘌呤底物溶液，于25 ℃水浴20 min 后加入0.5 mL 黃嘌呤氧化酶溶液以啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定其反應(yīng)速率。

2.5 黃嘌呤氧化酶抑制率及IC50測(cè)定 在“2.2.2”

項(xiàng)高效液相反應(yīng)體系中，樣品組加入各提取部位溶液（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg／mL）或別嘌醇溶液（50.00、25.00、12.50、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195 μg／mL），再加入0.5 mL 黃嘌呤氧化酶溶液以啟動(dòng)反應(yīng)，在25 ℃反應(yīng)30 min后，加入1 mL 1 mol／L鹽酸以終止反應(yīng)。同時(shí)制備空白組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組溶液，各取10 μL 進(jìn)行分析，采用SPSS 20.0 軟件計(jì)算抑制率及IC50。

2.6 有效部位抑制類型判斷 在“2.2.1”項(xiàng)紫外反應(yīng)體系中，保持黃嘌呤溶液濃度不變，測(cè)定黃嘌呤氧化酶溶液為0.025、0.05、0.10、0.20 U／mL時(shí)，不同提取部位各質(zhì)量濃度（1.0、2.0、4.0 mg／mL）對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響。以黃嘌呤氧化酶濃度為橫坐標(biāo)（X），反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)（Y），判斷有效部位對(duì)黃嘌呤氧化酶是否為可逆抑制。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 按“2.3”項(xiàng)下方法操作，制備溶液并轉(zhuǎn)移至比色皿中，在紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行多次檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果選定291 nm 作為尿酸檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 方法學(xué)考察 在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，黃嘌呤底物與尿酸產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為13.1、8.2 min，與其他組分分離度均大于1.5，峰型良好。其中黃嘌呤底物分離度最高，影響最小，故通過(guò)測(cè)定黃嘌呤的消耗量，以此來(lái)反映黃嘌呤氧化酶的活性，見圖1。分別吸取適量1.0 mmol／L黃嘌呤溶液進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定3次，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝1 579 588X－4 634，R2＝0.999 8，表明黃嘌呤在0.239～7.66 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取1.915 mg／mL 黃嘌呤溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得峰面積RSD 為0.21%，表明精密度良好。取1.915 mg／mL 黃嘌呤溶液，每隔2 h 進(jìn)樣測(cè)定1次，共7次，測(cè)得峰面積RSD 為0.92%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密吸取3.125 μg／mL別嘌醇溶液，按“2.2.2”項(xiàng)反應(yīng)體系平行制備6組，測(cè)定黃嘌呤峰面積，得質(zhì)量濃度為3.30 mg／mL，RSD 為1.8%，表明重復(fù)性良 好。精密吸取3.125 μg／mL別嘌醇溶液，按“2.2.2”項(xiàng)反應(yīng)體系加入2 倍黃嘌呤溶液，平行制備6組，測(cè)定黃嘌呤峰面積，得平均回收率為101.3%，RSD 為2.1%。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 黃嘌呤氧化酶最佳反應(yīng)濃度確定 在紫外反應(yīng)體系中，相同的底物濃度下，不同的黃嘌呤氧化酶濃度其反應(yīng)速率各不相同，可見隨著黃嘌呤氧化酶濃度的增加，酶促反應(yīng)初速度提高，其初速度和酶濃度呈正相關(guān)。當(dāng)體系中黃嘌呤氧化酶濃度為10、12.5、25 U／L時(shí)，反應(yīng)1 min 后速率趨向于零，可能因?yàn)辄S嘌呤氧化酶濃度較低，與黃嘌呤底物反應(yīng)后迅速失活導(dǎo)致。當(dāng)黃嘌呤氧化酶濃度為200、250 U／L時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間推移，反應(yīng)速率顯著降低，可能是由于黃嘌呤氧化酶濃度偏高，體系中底物消耗，導(dǎo)致速率降低。當(dāng)體系中黃嘌呤氧化酶濃度為50、100、150、200 U／L時(shí)，反應(yīng)速率都具有下降的趨勢(shì)，但其中黃嘌呤氧化酶濃度為50 U／L 時(shí)的前5 min，變化幅度最小，因此用該條件進(jìn)行下一步研究，見圖2。

圖2 黃嘌呤氧化酶濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.2 Effects of xanthine oxidase concentration on reaction rate

3.4 各提取部位對(duì)反應(yīng)速率的影響 在黃嘌呤氧化酶濃度為50 U／L 的紫外反應(yīng)體系中，加入桑寄生各提取部位，測(cè)定5 min 內(nèi)平均反應(yīng)速率，見圖3。隨著桑寄生質(zhì)量濃度的增加，酶促反應(yīng)速率均有不同程度的降低，說(shuō)明各提取部位對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制作用呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。其中乙酸乙酯和正丁醇部位為6.25～100 μg／mL時(shí)，酶促反應(yīng)速率顯著降低，為100～200 μg／mL 時(shí)反應(yīng)速率趨于平穩(wěn)；石油醚和三氯甲烷部位對(duì)反應(yīng)速率的影響較小。

圖3 提取部位對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.3 Effects of extraction site on reaction rate

3.5 各提取部位對(duì)抑制率影響 隨著桑寄生質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率不斷升高，說(shuō)明對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，見表1。當(dāng)質(zhì)量濃度為0～100 μg／mL時(shí)，乙酸乙酯和正丁醇部位抑制率增長(zhǎng)，為100 μg／mL時(shí)抑制率超過(guò)50%；其余部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率較低。由表1 可知，石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的IC50分別為338、466、73、67、1 424 μg／mL，可見乙酸乙酯和正丁醇部位的IC50遠(yuǎn)低于其他部位，因此選取乙酸乙酯部位和正丁醇部位進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.1 Inhibition rates of different extraction sites（，n＝3）

表1 不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.1 Inhibition rates of different extraction sites（，n＝3）

3.6 乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制率的影響 桑樹為寄主的桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位的IC50均小于100 μg／mL，其中當(dāng)各樣品質(zhì)量濃度大于100 μg／mL時(shí)，抑制率均大于50%。南寧產(chǎn)地的桑寄生乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度為200 μg／mL時(shí)，抑制率超過(guò)90%，其IC50值最小，為32.18 μg／mL；以河池產(chǎn)地的桑寄生正丁醇部位IC50值最高，為99.67 μg／mL。測(cè)定9 批不同寄主的桑寄生藥材乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率，結(jié)果得楓樹上的桑寄生正丁醇部位質(zhì)量濃度為200 μg／mL時(shí)，抑制率超過(guò)90%；其乙酸乙酯部位IC50值最低，為44.68 μg／mL。此外，除桑樹、楓樹、黃皮樹上的桑寄生正丁醇部位和桃樹、大葉冬青上的桑寄生乙酸乙酯部位外，其余寄主上的桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位IC50均大于100 μg／mL，見表2～3。

表2 不同產(chǎn)地桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.2 Inhibition rates of different extraction sites from different origin of Taxilli Herba（，n＝3）

表2 不同產(chǎn)地桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.2 Inhibition rates of different extraction sites from different origin of Taxilli Herba（，n＝3）

3.7 黃嘌呤氧化酶抑制類型 圖4 中各直線基本相交于原點(diǎn)，表明桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用為可逆性抑制。

圖4 乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effects of ethyl acetate and n?butanol moieties on xanthine oxidase

4 討論

黃嘌呤氧化酶為一種分布于臟器和血管的鉬羥化酶，是能催化次黃嘌呤與黃嘌呤使之產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶［10?11］。當(dāng)嘌呤代謝紊亂時(shí)，尿酸易積聚在各臟腑和關(guān)節(jié)中，引發(fā)高尿酸或痛風(fēng)疾病。治療手段多采用黃嘌呤氧化酶抑制劑來(lái)降低黃嘌呤氧化酶活性，進(jìn)而減輕尿酸引起的危害。黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選［12?13］主要通過(guò)紫外分光光度法來(lái)檢測(cè)酶促反應(yīng)速率及相關(guān)酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)，但在以中藥作為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，因其所含化合物眾多，在紫外光下多具有較強(qiáng)的吸收，易超出儀器的檢測(cè)靈敏范圍，同時(shí)由于其專屬性差，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果?？赏ㄟ^(guò)高效液相色譜法來(lái)分離樣品成分、黃嘌呤底物和尿酸產(chǎn)物，從而建立其專屬性檢測(cè)［9］。本實(shí)驗(yàn)采用建立紫外與高效液相結(jié)合的方法，通過(guò)HPLC 的專屬性來(lái)篩選出活性部位，并采用UV 法來(lái)探究其對(duì)黃嘌呤氧化酶的相關(guān)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)指數(shù)。利用該方法，初步證明桑寄生乙酸乙酯和正丁醇部位對(duì)黃嘌呤氧化酶具有較強(qiáng)的抑制活性，并且該抑制類型為可逆性抑制。同時(shí)，除桑樹外，桑寄生亦可在多種植物上生長(zhǎng)［14?16］，因此本研究考察了幾種常見植物［17］上的桑寄生對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除楓樹、桃樹、黃皮樹和大葉冬青這4 種植物外，其余植物上的桑寄生藥材IC50均大于100 μg／mL，少數(shù)植物達(dá)到200 μg／mL 以上，證明了桑寄生對(duì)黃嘌呤氧化酶抑制活性受到寄主植物的影響，且以桑樹為寄主的抑制作用最強(qiáng)。

表3 不同寄主的桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.3 Inhibition rates of different extraction sites from different hosts of Taxilli Herba（，n＝3）

表3 不同寄主的桑寄生不同提取部位的抑制率（，n＝3）Tab.3 Inhibition rates of different extraction sites from different hosts of Taxilli Herba（，n＝3）