紅芪小分子提取物對(duì)MSCs體外增殖與染色體的影響

紅芪小分子提取物對(duì)MSCs體外增殖與染色體的影響

王倩1岳衛(wèi)東劉永琦1，2，3

(寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院，陜西寶雞721300)

摘要〔〕目的探討紅芪小分子提取物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外增殖及染色體的影響。方法利用水提法結(jié)合超濾法提取紅芪中小分子物質(zhì)，并篩選其促進(jìn)MSCs增殖的最佳濃度。設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的MSCs為對(duì)照組，紅芪最佳濃度(20 mg/L)培養(yǎng)72 h后MSCs為實(shí)驗(yàn)組，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期；染色體顯色與計(jì)數(shù)分析細(xì)胞染色體；Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果紅芪濃度20 mg/L為最佳促進(jìn)MSCs增殖濃度(P<0.05)。倒置相差顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣；紅芪組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)類似于對(duì)照組。與對(duì)照組比較，紅芪組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著增快(P<0.05)；細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；染色體及MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平無異常改變(P>0.05)。結(jié)論紅芪小分子提取物20 mg/L體外培養(yǎng)MSCs 72 h后，對(duì)其增殖有明顯促進(jìn)作用，且維持其遺傳物質(zhì)染色體的穩(wěn)定性，其作用機(jī)制可能與調(diào)控MSCs的MMP-2、MMP-9等相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕紅芪；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；染色體；基質(zhì)金屬蛋白酶

中圖分類號(hào)〔〕R285〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81060351/H2810)

通訊作者：劉永琦(1973-)，男，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

1甘肅中醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)與中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化研究所

2甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：王倩(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療基礎(chǔ)研究。

Effect of micromolecule-aqueous extracts of Hongqi (Radix Hedysari) on the proliferation and chromosome of MSCs in vitro

WANG Qian，YUE Wei-Dong，LIU Yong-Qi.

The Second Chinese Medicine Hospital of Baoji，Baoji 721300，Shaanxi，China

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of micromolecule-aqueous extracts of Hongqi on proliferation and chromosome of mesenehymal stem cells (MSCs) in vitro.MethodsThe water-boiling method combined with ultrafiltration were used to extract the micromolecule-aqueous substances of Hongqi and the best concentration was screened for proliferative effect on MSCs.MSCs cultured alone was control group，and MSCs cultured with the best concentration of Hongqi (20 mg/L) for 72 h was experimental groups.The morphological changes in the cells were observed by phase-contrast microscopy.MTT assay was used to measure the cells changes in growth.The cell cycle of MSCs was determined by flow cytometry.Chromosome was examined by colored and counted.The expressions of MMP-2，MMP-9 proteins were determined by Western blot.Results20 mg/L micromolecule-aqueous extracts of Hongqi was best concentrations to promote the growth of MSCs (P<0.05).The cell morphologies were observed by phase-contrast microscopy，cells of MSCs were fibroblast-like，cells of Hongqi were long fusiform，closed to MSCs cells in morphology.Compared with MSCs，cells of Hongqi grow were faster (P<0.05)，the proportion of G0/G1 phase cells was reduced，while the proportion of S phase and G2/M phase were increased，but there was no statistical significance(P>0.05)，the chromosome and the proteins expressions of MMP-2，MMP-9 did not change abnormally(P>0.05).ConclusionsMicromolecule-aqueous extracts of Hongqi (20 mg/L) culturing MSCs for 72 h could improve proliferation of MSCs significantly，and preserve the genetic stability of MSCs'chromosome in vitro.The mechanism is related with the regulation of the expressions of MMP-2，MMP-9 proteins of MSCs.

【Key words】Hongqi (Radix Hedysari); Mesenhymal stem cells; Proliferation; Chromosome; Matrix metalloproteinase

目前研究表明，紅芪中有效成分包括多糖、黃酮、皂苷；此外，還含有機(jī)體必需的微量元素和部分氨基酸，其中1-3-羥基-9-甲氧基紫檀烷是紅芪的特有成分，是鑒別紅芪與黃芪的物質(zhì)基礎(chǔ)〔1〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅芪具有廣泛的藥理作用，包括調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、鎮(zhèn)痛、改善血流變及促進(jìn)損傷神經(jīng)再生等作用〔2〕。本研究通過觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外增殖及遺傳物質(zhì)染色體的變化，以期為紅芪聯(lián)合MSCs在細(xì)胞學(xué)治療的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器及試劑二氧化碳培養(yǎng)箱，日本三洋電機(jī)公司；雙人單面垂直送風(fēng)超凈工作臺(tái)，天津市泰斯特儀器有限公司；IX51型倒置式基礎(chǔ)型顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；IX81型活細(xì)胞成像系統(tǒng)，日本奧林巴斯株式會(huì)社；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)BIO-RAD公司；DV314C型精密電子天平，美國(guó)OHAUS公司；移液器research，德國(guó)eppendorf公司。DMEM/F-12、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)(美國(guó)Sigma公司)，兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體、兔抗人MMP-9 多克隆抗體(美國(guó)Bioworlde公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)超敏發(fā)光液(德國(guó)MILLIPORE 公司)。

1.2水提法結(jié)合陶瓷膜超濾法提取紅芪小分子物質(zhì)取紅芪飲片(購(gòu)自甘肅省安寧醫(yī)藥公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥制藥中醫(yī)藥科研二級(jí)實(shí)驗(yàn)室鑒定為正品)9.25 kg，加125 L去離子水煎煮2 h，得提取液，其藥渣再加125 L去離子水煎煮2 h，將兩次煎煮所得提取液經(jīng)50 nm陶瓷膜超濾，得透過液。再經(jīng)10 nm陶瓷膜超濾，得10 nm以下透過液(以上步驟在甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥制藥中醫(yī)藥科研二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成)。透過液經(jīng)熱回流抽提濃縮機(jī)濃縮、真空干燥箱干燥、粉碎機(jī)粉碎，得紅芪小分子物質(zhì)粉(由奇正藏藥有限公司制藥室完成)。稱取3 g，溶解于100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，0.22 μm微孔濾器過濾除菌。用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋濃度分別為20、40、60、80 mg/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)胞培養(yǎng)MSCs購(gòu)自Cyagen Biosciences Inc.(Catalog Number：HUXMA-01001；Registration Number：08795844465781)。MSCs培養(yǎng)體系為含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)傳代。細(xì)胞傳代時(shí)首先棄掉原培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液(與原培養(yǎng)液的比例為4∶1)，吹散制成單細(xì)胞懸液并分裝至新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)按照上述條件培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4紅芪小分子提取物促進(jìn)MSCs增殖最佳濃度的篩選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MSCs細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液稀釋成濃度約為5×104個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl。每96孔板中設(shè)空白組(僅含有培養(yǎng)液，不接種細(xì)胞)、對(duì)照組(接種細(xì)胞和含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液)、實(shí)驗(yàn)組(紅芪小分子提取物濃度分別為20、40、60、80 mg/L)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，空白組和對(duì)照組每孔均加入100 μl含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)各組分別加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h，每天固定時(shí)間每孔加20 μl MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h 后棄去液體，每孔加入150 μl DMSO，搖床上混勻10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值反映活細(xì)胞數(shù)量，其值越大則細(xì)胞數(shù)越多。

1.5實(shí)驗(yàn)分組取狀態(tài)良好的MSCs細(xì)胞(30%～40%融合)，棄掉原培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞2次，對(duì)照組加入含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組加入含最佳促進(jìn)MSCs增殖紅芪小分子提取物濃度、10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液(簡(jiǎn)稱紅芪組)，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后用于實(shí)驗(yàn)。1.6形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下，每日觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化，并照相記錄。

1.7MTT比色試驗(yàn)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線收集各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶37℃消化，倒置相差顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓后，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液，吹散制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/L，接種于96孔培養(yǎng)板中(各組細(xì)胞每個(gè)培養(yǎng)板中接種6孔，每孔200 μl，共7塊培養(yǎng)板)，在5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48 h換液一次。分別于接種后第1、2、3、4、5、6、7天進(jìn)行MTT法檢測(cè)。每天固定時(shí)間每孔加20 μl MTT(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去液體，加入150 μl DMSO，搖床上混勻10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.8流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期收集各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶37℃消化成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min后棄上清，PBS洗滌2次，緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜，然后1 000 r/min離心5 min，收集固定的細(xì)胞，PBS洗滌2次后離心棄上清，加入500 μl的PBS重懸細(xì)胞，再加入2.5 μl(10 g/L)RNase A混勻，37℃反應(yīng)30 min，過300目細(xì)胞篩，加入含1% Triton X-100的PI 50 μl(0.1 g/L)混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9染色體顯色實(shí)驗(yàn)分析染色體在各組細(xì)胞中加入秋水仙素(終濃度2 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心10 min。37℃的0.075 mol/L氯化鉀低滲，甲醇-冰醋酸(比例3∶1)固定。冰玻片滴片，室溫干燥，55℃干燥箱過夜。胰酶處理后Giemsa染色，油鏡下觀察拍照，各組細(xì)胞計(jì)數(shù)100分裂象的染色體，觀察染色體形態(tài)、數(shù)目，分析結(jié)果。

1.10Western印跡檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)水平在各組細(xì)胞分別加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量，各組蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜，加入兔抗人MMP-2多克隆抗體(1∶500)、兔抗人MMP-9多克隆抗體(1∶500稀釋)，室溫孵育2 h，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集攝取圖像，Quantity One軟件分析處理圖像。β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1不同濃度紅芪小分子提取物對(duì)MSCs增殖的影響20 mg/L紅芪小分子提取物作用不同時(shí)間后，能明顯促進(jìn)MSCs增殖(P<0.05)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，作用越強(qiáng)，具有時(shí)間依賴效應(yīng)；40 mg/L 紅芪小分子提取物作用24 h后，能促進(jìn)MSCs增殖(P<0.05)；60 mg/L紅芪小分子提取物作用72 h后，有促進(jìn)MSCs增殖的作用(P<0.05)；80 mg/L紅芪小分子提取物作用48 h后，對(duì)MSCs的增殖有一定的抑制作用(P<0.05)，而作用72 h后，有促進(jìn)MSCs增殖的作用(P<0.05)，提示紅芪小分子提取物20 mg/L對(duì)MSCs增殖促進(jìn)作用比較明顯，為最佳藥物作用濃度。見表1。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞邊界清晰，形態(tài)均一，為成纖維細(xì)胞樣，扁平，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，分布均勻，排列有序，呈漩渦樣貼壁生長(zhǎng)，折光性較強(qiáng)；紅芪組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，排列有序，接近于對(duì)照組。見圖1。

表1　各組細(xì)胞吸光度(A)值

與同一培養(yǎng)時(shí)間0 mg/ml組比較：1)P<0.05；與同一藥物濃度培養(yǎng)24 h 比較：2)P<0.05；與同一藥物濃度培養(yǎng)48 h比較：3)P<0.05

圖1　各組細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)

2.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組比較，紅芪組在第1、2、3、4、5、6、7 天，細(xì)胞生長(zhǎng)速度均顯著增快(P<0.05)。見圖2。

2.4FCM檢測(cè)細(xì)胞周期紅芪組G0/G1期細(xì)胞減少，S期和G2/M期細(xì)胞增多，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　FCM分析細(xì)胞周期的結(jié)果

2.5細(xì)胞染色體分析在顯微鏡下選擇分散良好且比較完整的中期分裂象進(jìn)行觀察，各組細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)100分裂象的染色體數(shù)目，結(jié)果顯示對(duì)照組染色體為46，正常二倍體，紅芪組細(xì)胞染色體數(shù)目為46條，與對(duì)照組細(xì)胞比較未見染色體斷裂、異倍體等異常改變。見圖3。

圖2　各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的變化

圖3　各組細(xì)胞染色體檢測(cè)結(jié)果(油鏡，×1 000)

2.6MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化與對(duì)照組(1 889.440±133.457，10 761.654±0.566)比較，紅芪組細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)量(1 972.785±241.872，11 074.660±596.044)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖4　Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白的表達(dá)水平

3討論

MSCs是來源于胚胎發(fā)育早期中胚層的成體干細(xì)胞，廣泛存在于各種組織中，在骨髓中含量較多，具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能。由于MSCs可塑性高、取材方便、易于體外分離、培養(yǎng)、極好的遷移能力、低免疫源性和不涉及倫理問題等特點(diǎn)〔3，4〕，所以被認(rèn)為是組織工程領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞來源和基因治療的重要靶細(xì)胞，已成為細(xì)胞學(xué)治療的最佳干細(xì)胞之一〔5〕。但骨髓中MSCs的含量極少〔6〕，必須在體外培養(yǎng)擴(kuò)增才能滿足臨床需求。還有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期體外擴(kuò)增MSCs，可致其出現(xiàn)永生化并顯現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)〔7〕。所以，如何從中藥中尋找促進(jìn)MSCs增殖的有效組分，以及MSCs經(jīng)體外大量擴(kuò)增后如何能很好地保持其遺傳穩(wěn)定性是目前研究的熱點(diǎn)。

MSCs具有較強(qiáng)的自我增殖和多向分化潛能，不僅可以定向誘導(dǎo)分化為中胚層細(xì)胞，而且還可跨胚層分化為內(nèi)胚層及外胚層來源的細(xì)胞〔3〕；同時(shí)，MSCs具有易于從自體獲取、體外分離、培養(yǎng)及外源基因的導(dǎo)入，極好的遷移能力和回植后不易發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)〔4〕，已成為眾多領(lǐng)域臨床細(xì)胞學(xué)治療的最佳干細(xì)胞之一〔5〕?？梢?，MSCs對(duì)組織、器官的修復(fù)和替代具有重要的作用，且還是研究增殖與分化機(jī)制的模型。但MSCs 在骨髓中的含量極少，每1×106個(gè)骨髓單核細(xì)胞中僅有2～5個(gè)〔6〕，必須通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增才能滿足臨床需要。還有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期體外擴(kuò)增MSCs，可致其出現(xiàn)永生化并顯現(xiàn)腫瘤細(xì)胞特點(diǎn)，如形態(tài)變小、致密，表面標(biāo)志物表達(dá)異常，接觸抑制減弱及端粒酶活性增強(qiáng)等，移植入動(dòng)物體內(nèi)，可形成腫瘤〔7〕。所以，MSCs經(jīng)體外大量擴(kuò)增后如何能很好地保持其遺傳穩(wěn)定性是目前研究的熱點(diǎn)。

中藥主要通過多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)，在蛋白、基因水平調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化，阻斷正常細(xì)胞突變，從而在細(xì)胞水平上發(fā)揮“扶正”、“祛邪”的治療作用，為中醫(yī)的治則拓展了新的思路，為中醫(yī)藥理學(xué)理論帶來新的詮釋〔8〕。有研究認(rèn)為，干細(xì)胞具先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式〔9〕，且中醫(yī)理論認(rèn)為“益氣補(bǔ)血”、“精血同源”，補(bǔ)氣生髓化血。黃芪為補(bǔ)中益氣要藥，紅芪屬于黃芪的一種，與黃芪同科異屬。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芪研究較多，而對(duì)紅芪及其有效成分的藥效和藥理學(xué)研究較少，且還處于初步階段，許多分子生物學(xué)作用機(jī)制尚不清楚。

紅芪有效成分黃酮、皂苷、氨基酸、低聚糖、寡糖及微量元素等均為小分子物質(zhì)，含量較高，加強(qiáng)對(duì)其深入研究，將為紅芪的進(jìn)一步開發(fā)和廣泛臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。陶瓷膜超濾技術(shù)是以復(fù)合陶瓷膜為過濾介質(zhì)，以壓力差為推動(dòng)力，利用陶瓷膜皮膚層上5～100 nm的微孔進(jìn)行選擇性篩分，實(shí)現(xiàn)對(duì)多組分混合物的物理分離、純化、富集和濃縮的一種膜分離技術(shù)〔10〕。選擇一定分子截留量的超濾膜，可實(shí)現(xiàn)有效成分與雜質(zhì)的分離，保留中藥原有的復(fù)方特色，使其在最大程度上發(fā)揮藥效。研究表明紅芪黃酮類、苷類等絕大多數(shù)相對(duì)分子質(zhì)量在1 000以下。本研究選用陶瓷膜超濾技術(shù)對(duì)分子量不同物質(zhì)進(jìn)行切分，10 nm陶瓷膜超濾透過液中獲得小分子物質(zhì)。

干細(xì)胞的歸巢是一個(gè)復(fù)雜的過程，與正常白細(xì)胞的歸巢類似，MSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附并穿越胞外基質(zhì)，此過程與MMP-2、MMP-9等有關(guān)。MMPs屬于細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶家族，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，如MSCs、成纖維細(xì)胞等〔11〕。近年來，越來越多的研究證實(shí)干細(xì)胞的分化行為高度依賴于其生存的微環(huán)境，干細(xì)胞微環(huán)境影響干細(xì)胞MMPs的表達(dá)變化，MMPs在MSCs自我更新、分化、運(yùn)動(dòng)等多種生物學(xué)行為中起著重要的調(diào)節(jié)作用〔12〕。MMP-2、MMP-9具有降解明膠，切割層黏連蛋白、彈性蛋白以及趨化因子能力。MMP-2主要功能為降解基底膜中的纖維連接蛋白和層黏連蛋白；而MMP-9主要功能為分解基底膜中的巢蛋白。

本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，紅芪組細(xì)胞增殖迅速、生長(zhǎng)活躍，具有接觸抑制現(xiàn)象，表明紅芪增強(qiáng)MSCs自我更新能力。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，紅芪對(duì)MSC有明顯促進(jìn)增殖的作用，與細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果一致。上述結(jié)果相互印證了紅芪不僅可以促進(jìn)MSCs增殖，且維持其遺傳物質(zhì)染色體的穩(wěn)定性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)有關(guān)，為紅芪聯(lián)合MSCs在細(xì)胞學(xué)治療的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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〔2015-02-04修回〕

(編輯袁左鳴)