一種新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

一種新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

孫洋劉爽徐靜1王慧1周慶偉2

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130021)

摘要〔〕目的探討新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響。方法采用吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)及線粒體膜電位法檢測(cè)Lewis腫瘤細(xì)胞在48 h細(xì)胞凋亡情況，熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的變化。結(jié)果新型肽對(duì)Lewis細(xì)胞具有明顯促進(jìn)凋亡的作用。熒光顯微鏡下觀察：新型肽(2 000 μg/ml)治療組可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征性改變；線粒體膜電位顯著降低；細(xì)胞凋亡率明顯增加分別與空白對(duì)照及新型肽(1 000 μl/ml)治療組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論新型肽可能通過降低Lewis腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤生長(zhǎng)作用。

關(guān)鍵詞〔〕新型肽；Lewis腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位

中圖分類號(hào)〔〕R73〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：周慶偉(1959-)，男，教授，主要從事藥理學(xué)研究。

1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所

第一作者：孫洋(1990-)，女，在讀碩士，主要從事生物藥學(xué)研究。

目前肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔1～3〕。其傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療，或單獨(dú)放療/化療，但都難以提高其臨床療效〔4〕，其治愈率仍較低。目前國(guó)內(nèi)外已研究的抗腫瘤藥物眾多，但多數(shù)價(jià)格昂貴且不良反應(yīng)大。同時(shí)也存在耐藥性問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制〔5～7〕。為此，尋找高效、低毒、價(jià)廉的新的治療藥物已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究一種新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞凋亡作用的影響，并通過檢測(cè)Lewis細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位等變化，初步探討其抑制作用的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究新型肽在臨床上治療肺腫瘤提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑及藥品 Lewis細(xì)胞株：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑：(1)線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1，產(chǎn)品編號(hào)：C2006)；(2)吖橙啶( 中國(guó)北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司 批號(hào)：1AB10220)；(3) 新型肽為本研究室設(shè)計(jì)，由中國(guó) 上海吉爾公司合成，純度為98%；(4)博來(lái)霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：2131001)；(5)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，批號(hào)：TBD31HB)。

1.2主要儀器(1)熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i (日本尼康公司)；(2)二氧化碳培養(yǎng)箱 ( 日本 三樣電機(jī)株式會(huì)社制造 產(chǎn)品型號(hào)：NCO-15AC)；(3) AN YANG 超凈臺(tái) (中國(guó) 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司 型號(hào)：BSC-BOOⅡB2)。

1.3方法

1.3.1吖橙啶/溴乙啶(AO/EB)雙染細(xì)胞爬片取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis腫瘤細(xì)胞，0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞懸液3×105Cells/ml接種6孔板中，1 ml/孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h，細(xì)胞貼壁； 隨機(jī)分為空白對(duì)照組、博來(lái)霉素組及不同濃度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，50 μl/孔，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h；③ 取出爬滿細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，在蓋玻片上滴加AO和EB染液各5 μl。立即在熒光顯微鏡下觀察、拍照。每個(gè)視野計(jì)數(shù)所含的程序性死亡細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)計(jì)算細(xì)胞程序性凋亡率。

1.3.2JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis腫瘤細(xì)胞，常規(guī)消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105/ml，接種在6孔板，1 ml/孔。置入37℃，5% CO2孵育4 h，細(xì)胞貼壁；隨機(jī)分為CCCP陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組、博來(lái)霉素(100 μg/ml)組及不同的濃度新型肽(1 000、1 500及2 000 μg/ml)組，50 μl/孔，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，每孔終體積2 ml。置入37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。CCCP組(作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照)，每孔加入CCCP(CCCP按照1∶1 000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中) 。博來(lái)霉素組與不同濃度的新型肽組每孔加入0.5 ml JC-1染色工作液。37℃孵育20 min后，棄掉上清液，用冰浴JC-1(1X)緩沖液沖洗細(xì)胞2次后，每孔加入1 ml培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1AO/EB雙染熒光染色對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察新型肽作用于Lewis腫瘤細(xì)胞48 h，采用AO/EB染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組可見大量被染成的綠色細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，胞核完整，界限清楚。隨著藥物濃度的增加，正常細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多，其細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)發(fā)出紅色熒光。新型肽(2 000 μg/ml)組細(xì)胞凋亡率〔(20.24±0.34)%〕分別與空白對(duì)照組〔(5.44±0.99)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)組〔(10.66±0.32)%〕比較具有顯著性差異(P<0.05)；新型肽(2 000 μg/ml)組與博來(lái)霉素組〔(20.38±0.19)%〕比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)另外新型肽(1 500 μg/ml)凋亡率為〔(15.20±0.22)%〕，見圖1。

2.2新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的影響熒光顯微鏡下可見，CCCP陽(yáng)性對(duì)照組，經(jīng)10 μmol/L濃度處理20 min后C6腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體的膜電位完全喪失JC-1染色后呈綠色熒光?？瞻讓?duì)照組，大多數(shù)細(xì)胞染色呈紅色熒光。新型肽(2 000 μg/ml)組作用于Lewis腫瘤細(xì)胞48 h：多數(shù)細(xì)胞呈綠色熒光，細(xì)胞呈梭形，提示細(xì)胞發(fā)生凋亡；紅色熒光的細(xì)胞呈園形，但突起較正常對(duì)照組和新型肽(1 000 μg/ml)組及新型腫瘤抑素(1 500 μg/ml)組的紅色熒光細(xì)胞呈圓形。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞線粒體膜電位均有不同程度下降，新型肽(2 000 μg/ml)組〔(28.18±0.19)%〕分別與空白對(duì)照組〔(11.06±0.37)%〕及新型肽(1 000 μg/ml)組〔(16.10±0.16)%〕比較具有顯著差異(P<0.05)，新型肽(2 000 μg/ml)組與博來(lái)霉素組〔(28.12±0.24)%〕比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CCCP組為100%,新型肽(1 500 μg/ml)為〔(22.14±0.21)%〕。見圖2。

圖1　新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞48 h凋亡的作用(×20)

圖2　新型肽對(duì)Lewis腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位的影響(×20)

3討論

惡性腫瘤由基因變異所導(dǎo)致并呈無(wú)限增殖、凋亡機(jī)制紊亂等特點(diǎn)，已經(jīng)成為全世界最主要的死亡原因之一。鑒于傳統(tǒng)抗腫瘤藥物往往選擇性差、毒副作用大，其治愈率仍較低。對(duì)其治療至今尚無(wú)突破性進(jìn)展。為此，尋找高效、低毒、療效穩(wěn)定的抗腫瘤藥物是目前研究開發(fā)的重點(diǎn)，而新型的多肽藥物恰恰具備了這些優(yōu)點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生是多途徑、多步驟的，還與細(xì)胞凋亡有關(guān)，細(xì)胞增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一〔8～11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸增加。

JC-1是廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的一種理想光探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1集聚在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能集聚在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)成為單體狀態(tài)，產(chǎn)生綠色熒光。這樣通過光顏色就可以非常方便地檢測(cè)線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件〔12，13〕。本研究表明新型肽可能直接作用于Lewis細(xì)胞線粒體，使線粒體膜通透性增加，線粒體跨膜電位下降，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上，新型肽可使線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)Lewis腫瘤細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制可能與線粒體膜電位下降有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)