P16及CyclinD1在胃癌癌變過程中的作用及意義

P16及CyclinD1在胃癌癌變過程中的作用及意義

劉亮張建海左連富

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細(xì)胞室，河北石家莊050011)

摘要〔〕目的通過檢測(cè)慢性萎縮性胃炎、胃不典型增生組織及胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白的表達(dá)，探討P16及CyclinD1與胃癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。 方法利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)慢性萎縮性胃炎、胃不典型增生組織及胃癌中P16及CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，利用SPSS軟件進(jìn)行胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白表達(dá)相關(guān)性分析。結(jié)果P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(91.7%)顯著高于不典型增生組織(69.2%)及胃癌組織(45%)中的表達(dá)(P<0.05)。CyclinD1蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(65%)顯著高于胃不典型增生組織(34.6%)及慢性萎縮性胃炎組織(29.2%)中的表達(dá)(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，胃癌組織中P16及CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論P(yáng)16及CyclinD1蛋白異常表達(dá)在胃癌癌變?cè)缙诩匆寻l(fā)生，聯(lián)合檢測(cè)P16及CyclinD1可為胃癌早期診斷提供客觀指標(biāo)。

關(guān)鍵詞〔〕胃癌；基因；細(xì)胞周期素；免疫組織化學(xué)

中圖分類號(hào)〔〕R735.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20110131);河北省自然科學(xué)基金(H2013206446)

通訊作者：左連富(1949-)，男，教授，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

第一作者：劉亮(1981-)，男，副教授，博士，主要從事腫瘤的早期診斷及治療研究。

Role of P16 and CyclinD1 protein expression in the process of gastric cancer and its significance

LIU Liang,ZHANG Jian-hai,ZUO Lian-Fu.

Department of FCM Analysis,Tumor Institute,the Forth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,Hebei,China

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression level and the development of gastric cancer by detecting the P16 and CyclinD1 protein expression in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue.MethodsExpressions of P16 and CyclinD1 protein in chronic atrophic gastritis,gastric dysplasia and gastric cancer tissue were detected by immunohistochemistry and the relationship between the P16 and CyclinD1 protein expression in gastric cancer was analyzed by SPSS software.ResultsThe positive expression rate of P16 protein in chronic atrophic gastritis(91.7%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(69.2%)and gastric cancer tissue(45%)(P<0.05).The positive expression rate of CyclinD1 protein in gastric cancer tissue(65%)was significantly higher than that of gastric dysplasia(34.6%)and chronic atrophic gastritis(29.2%)(P<0.05).P16 and CyclinD1 protein positive expression rate in gastric cancer tissue was significantly negative correlation(P< 0.05).ConclusionsThere are abnormal expressions of P16 and CyclinD1 protein in early gastric cancer,the combined detection of P16 and CyclinD1 protein could provide objective index for early diagnosis of gastric cancer.

【Key words】Gastric neoplasms;Gene;Cyclin;Immunohistochemistry

胃癌是較常見的惡性腫瘤〔1〕，近年發(fā)病率上升〔2〕，然而，胃癌的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明，為臨床上胃癌的早期診斷及治療帶來一定困難。目前對(duì)于腫瘤發(fā)生機(jī)制研究認(rèn)為，多種癌基因及抑癌基因的異常從而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。p16基因是抑癌基因，對(duì)正常細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子〔3,4〕。CyclinD1基因是一種原癌基因，是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖〔5〕。本課題探討P16及CyclinD1蛋白在不同病變的胃組織中的表達(dá)水平。

1材料與方法

1.1組織標(biāo)本采用河北省腫瘤研究所病理研究室存檔胃鏡咬檢的石蠟包埋胃黏膜組織50例(慢性萎縮性胃炎24例，不典型增生26例)及河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科2003年2月至2003年8月手術(shù)切除胃癌標(biāo)本20例，均有完整的病理資料。其中不典型增生組織輕度14例，中重度12例；胃癌組織中，中高分化9例，低分化11例。所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋制成4 μm厚切片4張，其中一張切片HE染色進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，其余3張切片用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2主要儀器及試劑鼠抗人p16單克隆抗體(ZM-0205;克隆系：16P07)，鼠抗人細(xì)胞周期素D1單克隆抗體(ZM-0084;克隆系：DCS-6)，Sp試劑盒(sp-9000)及DAB顯色劑，美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織塊切成4 μm厚切片，每個(gè)蠟塊各做4張切片。第一張用于HE染色，第二張用0.01%PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，第三、四張分別行抗P16、CyclinD1抗體標(biāo)記P16、CyclinD1蛋白，免疫組織化學(xué)染色用鏈菌素親生物素-過氧化物酶(SP)法。常規(guī)脫蠟至水，3%甲醇H2O2溶液室溫10 min，而后用蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)95℃以上孵化20 min。每張切片加5 μl 10% 山羊血清封閉10 min。分別滴加50 μl P16、CyclinD1(均為即用型)單克隆抗體，4℃冰箱過夜。其后PBS沖洗3次，每次5 min。滴加50 μl鏈霉素蛋白-過氧化氫酶溶液，用以標(biāo)記二抗，孵育30 min，其后PBS沖洗3次，每次5 min。分別滴加50 μl辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，室溫下孵育30 min，其后PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加100 μl左右新鮮配置的DAB溶液顯色，鏡下觀察顯色反應(yīng)，顯色適度時(shí)終止反應(yīng)，一般15～30 min。流水沖洗后，蒸餾水洗一次，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核4 min后，分化，返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)P16及CyclinD1蛋白表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)P16參照Geradts〔6〕標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。陰性(-)表示未見陽(yáng)性著色細(xì)胞，或僅有胞質(zhì)著色而每高倍鏡下胞核著色細(xì)胞個(gè)數(shù)≤1；弱陽(yáng)性(+)表示著色較淺或著色細(xì)胞數(shù)≤25%者；陽(yáng)性()表示著色深度適中或著色細(xì)胞數(shù)占25%～50%者；強(qiáng)陽(yáng)性()表示著色較深或著色細(xì)胞數(shù)>50%者；所有陽(yáng)性樣本必須滿足每高倍鏡下核著色細(xì)胞個(gè)數(shù)≥2。CyclinD1參考Betticher等〔7〕標(biāo)準(zhǔn)：未見陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)弱，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)<20%為陰性(-)，中等強(qiáng)度的表達(dá)≥20%為陽(yáng)性(+)，≥50%為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)的組間比較進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間比較行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法。

2結(jié)果

2.1不同胃病變組織中P16蛋白表達(dá)水平慢性萎縮性胃炎區(qū)域，可見腺上皮萎縮、變性，部分腺體呈囊性擴(kuò)張，P16蛋白表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；B區(qū)為不典型增生區(qū)域，表現(xiàn)為腺體形狀大小不規(guī)則、分枝或囊性擴(kuò)張，排列紊亂，上皮細(xì)胞數(shù)量增加，核變卵圓形或筆桿狀，排列擁擠，位于細(xì)胞的基底部，P16蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)；胃腺癌組織中腺管結(jié)構(gòu)不明顯，癌細(xì)胞分化較差，大小不甚一致，核常呈復(fù)層，P16蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。各組樣本中均有不同程度的P16蛋白表達(dá)，P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組中陽(yáng)性表達(dá)率(91.7%)顯著高于不典型增生組(69.2%，P<0.05)，不典型增生組與胃癌組(45.8%)之間無顯著性差異(P>0.05)，輕度不典型增生組(78.6%)與中～重度不典型增生組之間無顯著性差異(58.3%，P>0.05)，中～高分化腺癌與低分化腺癌之間無顯著性差異(55.6% vs 36.4%，P>0.05)。

圖1　不同病變組織P16、CyclinD1蛋白表達(dá)(DAB，×100)

2.2不同胃病變組織中CyclinD1蛋白表達(dá)水平慢性萎縮性胃炎組織，CyclinD1蛋白表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，呈弱陽(yáng)性表達(dá)； 不典型增生組織，CyclinD1蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)；胃腺癌組織，CyclinD1蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。各組樣本中均有不同程度的CyclinD1蛋白表達(dá)，CyclinD1蛋白在胃癌組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于不典型增生組(65.0% vs 34.6%,P<0.05)，不典型增生組與慢性萎縮性胃炎組(30.4%)間無顯著差異(P>0.05)，中～重度不典型增生組與輕度不典型增生組之間無顯著性差異(50% vs 27.3%,P>0.05)，低分化腺癌與中～高分化腺癌之間無顯著性差異(81.8% vs 44.4%,P>0.05)，CyclinD1蛋白在慢性萎縮性胃炎組中表達(dá)率最低(29.2%)，隨著病變進(jìn)展，其陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高。

2.3胃癌組織中P16和CyclinD1蛋白表達(dá)水平相關(guān)性分析胃癌組織中P16和CyclinD1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.555，P=0.011)。

3討論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第二位，具有較強(qiáng)的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力，致死率較高。胃癌的病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明，但研究發(fā)現(xiàn)癌癥的發(fā)生是多因素、多因子參與的，多種癌基因激活及抑癌基因的失活從而導(dǎo)致癌的發(fā)生及發(fā)展。

p16基因是由Kamb等〔8,9〕發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，定位于p21不到40 kb的范圍內(nèi)，由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成。三個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為126，307和11 bp，編碼一個(gè)16 kD的蛋白，即P16蛋白。P16既是正常細(xì)胞周期有效調(diào)控者(負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用)，又是抑制腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵成分。P16蛋白能與CyclinD1競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合CDK4和CDK6，抑制其活性，使其一系列底物(如pRb)保持持續(xù)去磷酸化高活性，而不能解除pRb對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F等的抑制，從而阻止細(xì)胞G1期進(jìn)入S期，直接抑制細(xì)胞增殖。因此，p16基因異常，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和腫瘤發(fā)生。

本研究顯示，各組樣本中均有不同程度的P16蛋白表達(dá)，P16蛋白在慢性萎縮性胃炎組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于不典型增生及胃癌組，P16蛋白在胃癌中表達(dá)率最低，隨著病變從慢性萎縮性胃炎→不典型增生→癌的進(jìn)展，其陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，提示P16蛋白低表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道〔10〕p16基因缺失是胃癌發(fā)生的早期事件。不典型增生與慢性萎縮性胃炎比較P16蛋白表達(dá)顯示明顯的差異至胃癌出現(xiàn)顯著缺失，其原因可能是P16基因以多種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生。

CyclinD1基因是一種原癌基因，由351個(gè)腺嘌呤、392個(gè)胞嘧啶、376個(gè)鳥嘌呤和206個(gè)胸腺嘧啶組成。Inaba等〔11〕報(bào)道了cyclinD1基因在11q13的位置上。Hinds等〔12〕證實(shí)了CyclinD1有致癌作用。CyclinD1是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，與CDK4/CDK6結(jié)合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)在G1-S轉(zhuǎn)換期發(fā)生磷酸化，釋放出E2F，進(jìn)一步激活S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。本研究顯示，CyclinD1蛋白在胃癌組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于不典型增生及慢性萎縮性胃炎組，隨著病變從慢性萎縮性胃炎→不典型增生→癌的進(jìn)展，其陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔13,14〕，提示CyclinD1蛋白高表達(dá)可能發(fā)生在胃粘膜上皮癌變的早期階段，是重要的胃癌促發(fā)因素，可將其認(rèn)為是胃癌發(fā)生的早期事件。綜上，P16和CyclinD1蛋白異常表達(dá)在早期胃癌即已發(fā)生，且P16和CyclinD1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)P16和CyclinD1蛋白可為早期胃癌診斷提供客觀指標(biāo)，提高臨床上早期胃癌的診斷率，對(duì)于臨床上胃癌的早期診斷及治療具有重要意義。

4參考文獻(xiàn)

1Sehdev A,Catenacci DV.Gastroesophageal cancer:focus on epidemiology,classification,and staging〔J〕.Discov Med，2013；16(87):103-11.

2Gomez SL,Noone AM,Lichtensztajn DY,etal.Cancer incidence trends among Asian American populations in the United States,1990-2008 〔J〕.J Natl Cancer Inst， 2013；105(15):1096-10.

3Poi MJ,Knobloch TJ,Yuan C,etal.Evidence that P12,a specific variant of P16(INK4A),plays a suppressive role in human pancreatic carcinogenesis 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun， 2013； 436(2):217-22.

4Liggett WH Jr,Sidransky D.Role of the p16 tumor suppressor gene in cancer 〔J〕.J Clin Oncol， 1998；16(3):1197-206.

5Li YJ,Wei ZM,Meng YX,etal.Beta-catenin up-regulates the expression of cyclinD1,c-myc and MMP-7 in human pancreatic cancer:relationships with carcinogenesis and metastasis 〔J〕.World J Gastroenterol,2005;11(14):2117-23.

6Geradts J,Kratzke RA,Niehans GA,etal.Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2/multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2/MTS1)product p16INK4A in archival human solid tumors:correlation with retinoblastoma protein expression 〔J〕.Cancer Res,1995;55(24):6006-11.

7Betticher DC,Heighway J,Hasleton PS,etal.Prognostic significance of CCND1(cyclin D1)overexpression in primary resected non-small-cell lung cancer 〔J〕.Br J Cancer,1996;73(3):294-300.

8Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,etal.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types 〔J〕.Science,1994;264(5157):436-40.

9Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 〔J〕.Nature,1993;366(6456):704-7.

10Liu F,Zhang X,Cao WD,etal.Correlation between the expression of p16 and PCNA in grade of glioma 〔J〕.J Fourth Mil Med Univ,1999;20(7):587-99.

11Inaba T,Matsushime H,Valentine M,etal.Genomic organization,chromosomal localization,and independent expression of human cyclin D genes 〔J〕.Genomics,1992;13(3):565-74.

12Hinds PW,Dowdy SF,Eaton EN,etal.Function of a human cyclin gene as an oncogene 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1994;91(2):709-13.

13Srivastava V,Patel B,Kumar M,etal.Cyclin D1,retinoblastoma and p16 protein expression in carcinoma of the gallbladder 〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2013;14(5):2711-5.

14Umekita Y,Ohi Y,Sagara Y,etal.Overexpression of cyclinD1 predicts for poor prognosis in estrogen receptor-negative breast cancer patients 〔J〕.Int J Cancer,2002;98(3):415-8.

〔2014-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

《中國(guó)老年學(xué)雜志》被國(guó)際數(shù)家數(shù)據(jù)庫(kù)、檢索性期刊檢索機(jī)構(gòu)收錄情況

根據(jù)國(guó)際檢索機(jī)構(gòu)給中國(guó)科學(xué)技術(shù)期刊編輯學(xué)會(huì)國(guó)際交流工作委員會(huì)、中國(guó)高等學(xué)校自然科學(xué)學(xué)報(bào)研究會(huì)對(duì)外聯(lián)絡(luò)委員會(huì)發(fā)來的電子郵件及其附件統(tǒng)計(jì)整理, 《中國(guó)老年學(xué)雜志》2009年又被4種國(guó)際重要檢索系統(tǒng)列為來源期刊:

1)美國(guó)化學(xué)文摘(CA)，CODEN ZLZHAO，http://www.lib.dlut.edu.cn/layersec.asp；

2)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copernicus), http://journals.indexcopernicus. com/karta. Php;

3)日本《科學(xué)技術(shù)社(中國(guó)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù))》(JST, Japan Science & Technology Agency) (Chinese Bibliographic Database);

4)美國(guó)《烏利希期刊指南》(UPD,Ulrich′s Periodicals Directory), http://www. ulrichsweb. com/ ulrichsweb/