生物鐘與衰老退行性變關系的研究

何本進　梁慶華　胡才友　孫　亮　朱小泉　原惠萍　楊　帆　李星慧　秦嬌琴

賈春媛2　韓　晶2　杜建財2　張翻弟2　楊　澤2

2.北京醫(yī)院　北京老年醫(yī)學研究所　100730

國家科技部十二五支撐計劃(2012BAI10B01)；北京市科技新星計劃(Z12133002512058)

生物鐘與衰老退行性變關系的研究

何本進1,2梁慶華1※胡才友1※孫亮2朱小泉2原惠萍2楊帆2李星慧2秦嬌琴1,2

賈春媛2韓晶2杜建財2張翻弟2楊澤2

2.北京醫(yī)院北京老年醫(yī)學研究所100730

國家科技部十二五支撐計劃(2012BAI10B01)；北京市科技新星計劃(Z12133002512058)

【摘要】在自然環(huán)境下，生物體內(nèi)的生物鐘接受外界光-暗和溫度等周期信號，調(diào)整自身的時相，與外界環(huán)境保持同步。生物鐘控制著晝夜節(jié)律，使其具有內(nèi)源性和自我維持運轉的特點。通過裸藻野生型和突變株系在生理生化等方面節(jié)律的變化，進一步分析起決定性作用的生物鐘成分，從而深入剖析生物鐘與晝夜節(jié)律之間的機制,及生物鐘與衰老退行性變關系，本文對此進行了綜述。

【關鍵詞】生物鐘晝夜節(jié)律細胞分裂周期纖細裸藻

幾乎所有生物的許多生理活動和生化反應都表現(xiàn)出一種內(nèi)源性的近似1小時的晝夜節(jié)律現(xiàn)象，晝夜節(jié)律是自然界最普遍的一種現(xiàn)象，可使生物體的生理、生化、行為等生命現(xiàn)象發(fā)生周而復始的節(jié)律性變化。這些晝夜節(jié)律現(xiàn)象受生物鐘調(diào)節(jié)，內(nèi)源性生物鐘是產(chǎn)生晝夜節(jié)律的基礎。裸藻是介于動物和植物之間的單細胞真核生物, 有光條件下葉綠體產(chǎn)生類囊體, 有光合功能產(chǎn)生, 成為自養(yǎng)型代謝；暗條件下葉綠體不能發(fā)育形成類囊體結構, 只能進行異養(yǎng)型的代謝。本文綜述了在裸藻野生型與突變株系中晝夜節(jié)律對細胞分裂節(jié)律的影響以及生物鐘與晝夜節(jié)律振蕩器之間的作用機制。

1.野生型和突變裸藻的細胞分裂節(jié)律性

許多藻類、真菌和原生動物的細胞分裂周期顯示出細胞分裂或“孵化”的持續(xù)晝夜節(jié)律[1]。細胞分裂只發(fā)生在特定的晝夜循環(huán)相位——經(jīng)常有恒定的黑暗或光照(人工黑夜)，相當于同步化晝夜循環(huán)中的黑暗間隔。這種“閥門效應器”現(xiàn)象反映一種晝夜振蕩器(CO)和細胞分裂周期(CDC)之間的相互關系，在裸藻中已經(jīng)被廣泛研究[2]。因為其將作為一種基本的機制分析，通過實現(xiàn)生物鐘與細胞周期之間耦合，所以我們要深入探討節(jié)律的種類。

1.1野生型株系晝夜生物鐘的典型特性——通過白天而不是1小時光照和溫度循環(huán)、持久性、起始反應性、可移動性、相位奇點和溫度補償來導引——發(fā)現(xiàn)可以用來描述在光合自養(yǎng)生長、綠色野生型株系中細胞分裂的節(jié)律[3～5]。其中后兩個特性更值得一提。

1.2奇異點數(shù)學研究已經(jīng)預測，晝夜振蕩器可能被描述為無節(jié)律的，顯示為無相性、靜止狀態(tài)——在晝夜周期特定時間(把這個“奇異點”叫S*)給予一定強度和持續(xù)時間的臨界相[6,7]。隨著刺激強度的增加，過渡期從1型(弱脈沖)到0型(強脈沖)，復位在特定階段的點必需是不連續(xù)的，這個“斷點”是相當于唯一的奇點。這種預測已經(jīng)在一些晝夜系統(tǒng)的光和化學干擾中得到證明，潛在的細胞分裂節(jié)律的時鐘也不例外。

奇異點的定位在纖細裸藻光合自養(yǎng)生長的細胞，細胞分裂的晝夜振蕩器潛在不同步的節(jié)律行為受一種“臨界的” 3小時光信號所干擾。最初三個同相位、一起分裂的細胞都被利用，在一種3小時光照：3小時黑暗生活規(guī)則中，每一個細胞顯示一個約19小時穩(wěn)定的τ。在晝夜時間(CT)0.4里，3小時的700勒克斯信號干擾細胞A而細胞B僅被3小時的190勒克斯干擾(在施加的晝夜循環(huán)里，每替換正常光間隔中的一個，就有7500勒克斯的強度，用陰影箭頭代表)。而前者的信號引出一個相位漂移(ΔΦ) +11.2小時(以1為模式)晝夜時間(實時等于14.0小時)，與之相比較的，見到7500勒克斯光信號，盡管在群體中細胞分裂繼續(xù)，但后者更弱的光脈沖(曲線B)誘導無節(jié)律性。如果三分之一細胞(曲線C)被一個與190勒克斯相同強度的3小時信號所干擾，在一個輕微不同的晝夜時間(CT21.5)里卻被加強，盡管相位在某種程度上觀察到7500勒克斯脈沖時被延遲(ΔΦ=-8.0小時，CT實時等于-10.0小時)，但細胞分裂節(jié)律繼續(xù)。(摘自Malinowski JR, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.J Comp Physiol B，1185，155:257-267.? Springer-Verlag.)圖1　相位漂移節(jié)律

這個“臨界脈沖”的存在和其相對應的S*不僅更加支持裸藻這種晝夜振蕩器調(diào)節(jié)細胞分裂周期的假設，也表明起搏器可能限制循環(huán)動力學。因為結果是由細胞群體獲得，所以在單個細胞中我們不能推斷振蕩器的這種狀態(tài)。細胞的無節(jié)律性也許就是單個細胞分裂周期位相分散的結果(細胞不連貫)，引起脈沖不同地相位漂移同步化的細胞?；蛘?，臨界脈沖也許已停止由群體組成的每一個晝夜節(jié)律時鐘(但不是繼續(xù)進行的細胞分裂周期)。

1.3光誘導定型與光周期的控制裸藻和綠色裸藻更早的研究工作表明細胞分裂周期由兩個連貫的過程組成[10～14]：預定型階段和定型階段。在細胞分裂周期的G1期，前者的過程將依賴光合作用生長。A點表示G1期細胞的生長進程是依賴光的時間，而T點代表細胞甚至在晚上都能完成細胞分裂周期的時間。如果預定型階段的細胞轉移到連續(xù)黑暗，細胞分裂會被立即阻止在A點與T點間某處，而當定型階段的細胞轉移到連續(xù)黑暗，細胞分裂周期的剩余時間繼續(xù)進行，直到接下來的周期停止在A點[10]。裸藻細胞分裂周期進程中的光合作作用規(guī)則就類似于異養(yǎng)型生物的營養(yǎng)控制。釀酒酵母或粟酒裂解酵母的營養(yǎng)匱乏，使細胞分裂周期停留在G1期或者G2期[15～17]，而前進已經(jīng)超出了“開始”(在G1/S邊界)或者控制大小檢測點的酵母細胞致力于完成細胞分裂周期，即使它們正在經(jīng)受饑餓[18]。

一項裸藻在對數(shù)線期能進行光合自養(yǎng)生長的細胞分裂周期進程中晝夜效應的研究，Hagiwara等[19]證明黑暗誘導細胞分裂周期停滯和光誘導定型向細胞周期轉變。不僅在G1期，也在后G1期發(fā)現(xiàn)光依賴的限制點。因此，如果營養(yǎng)從連續(xù)光照轉移到連續(xù)黑暗，在G1, S 或者G2期的一些(定型的)細胞甚至在連續(xù)黑暗時就能經(jīng)歷一個或兩個細胞分裂周期過渡，最終停滯在S期、G2期或有絲分裂G1后期。其他(未定型的)細胞在細胞分裂周期是不能繼續(xù)前進的。接受更高強度光照的定型細胞，更可能在連續(xù)黑暗時經(jīng)歷細胞周期轉變，以及在每個細胞分裂周期中更早地定型。在細胞分裂周期的G1, S 或 G2期的固定相點不能完成定型。

因此，裸藻細胞分裂周期轉變的定型，由光強度組成細胞周期相位的成熟度控制。另外，Hagiwara等[20]已經(jīng)證明，晝夜振蕩器可以調(diào)節(jié)這些細胞分裂周期相位轉變定型的光響應。當裸藻細胞被14小時光照：10小時黑暗調(diào)節(jié)，然后被轉移到連續(xù)黑暗時，在最后晝夜光周期的第8個小時，細胞就停滯在G1、S或G2期。隨后這些在不同晝夜時間暴露6小時光脈沖的暗停滯細胞，在細胞分裂周期以依賴脈沖的晝夜時間方式允許它們進一步推進(圖2)。光誘導的最大值發(fā)生在微暗的環(huán)境(晝夜時間CT12)。這些結果證明有一種細胞周期轉變定型的光誘導的晝夜閥門效應器，不只是細胞分裂，也更早涉及這些部分——細胞繁殖的光周期調(diào)節(jié)。應用除草劑敵草隆(DCMU)、DBMIB、甲基紫精(TMPD)和CCCP作抑制試驗的結果顯示：細胞分裂G2期細胞的光誘導定型，在非周期性光合作用的電子傳遞中，需要源自上游信號的光，特別是細胞色素b6-f，但不需要進程中所要求的能量代謝[20]。

纖細裸藻Z細胞分裂光誘導定型的晝夜閥門效應器和光周期的控制。細胞被調(diào)節(jié)到14小時光照：10小時黑暗，然后給予最后一個在釋放到連續(xù)黑暗之前縮短到8小時的光周期。隨后，細胞在不同的晝夜時間(所謂“暗期干擾”試驗)給予一個6小時的光照間隔。上圖：在細胞群生長中因子增加(ss) 是由光脈沖誘導。下圖：每行代表在延伸夜晚的連續(xù)黑暗之間，6小時光照間隔的時間設置[T范圍，“人工的”晝夜循環(huán)開始后數(shù)小時，在面板之間由白色和陰影線條顯示，表示前面的14小時光照：10小時黑暗循環(huán)仍在繼續(xù)。在黑暗間隔中間繪制數(shù)據(jù)(封閉空間)]，通過這些數(shù)據(jù)，橫線顯示它們的持續(xù)時間(6小時)。每一數(shù)據(jù)點下的數(shù)字表示試驗重復次數(shù)； SEM 很小以致誤差線都被隱藏在數(shù)據(jù)點內(nèi)。(摘自 Hagiwara S, Bolige A, Zhang Y et al.Photochem Photobiol，2002，27:31-39.? American Society for Photobiology.)圖2　細胞分裂周期的光誘導定型與光周期

1.4突變株系為了消除生物鐘可能存在的細胞間區(qū)和排除之前常引起節(jié)律性及提供生長能量的可能信號影響，我們已經(jīng)選了無葉綠素的裸藻ZC突變株——一種必需的有機異養(yǎng)型生物——一系列用來平行于那些在野生型株系中開展的研究[16]。細胞分裂節(jié)律可能被12小時光照:12小時黑暗調(diào)節(jié)，或甚至由單脈沖架構的光周期調(diào)節(jié)(1小時光照:23小時黑暗)，節(jié)律跟隨著連續(xù)黑暗自由振蕩至少8天(τ=25.5小時)，提供總的增長速率或世代時間(g)>1小時(圖5)。類似地，從其他裸藻光合作用的突變株中很少獲得這樣的結果，比如白色、熱褪色、無葉綠素的W6ZHL株系和紫外光誘發(fā)P4ZUL突變株[1,13,15]。ZC突變株光信號的0型相位反應期曲線是從15個相位漂移試驗中生成[16](圖3)；這條相位反應曲線(圖4)類似于先前用野生型株系獲得的結果[9]。這些研究為細胞分裂周期控制中晝夜振蕩器的作用，提供了更加確鑿的證據(jù)，有效避免了施加晝夜循環(huán)雙用途的問題：作為生長的能源或者“基質(zhì)”和作為潛在生物鐘的時間暗示(授時因子)。

先前被12小時光照:12小時黑暗調(diào)節(jié)，纖細裸藻(Z株系)無葉綠素的ZC突變株，在連續(xù)黑暗里，不同晝夜時間給予1小時光信號(1900勒克斯)調(diào)節(jié)，在添加乙醇的礦質(zhì)培養(yǎng)基中16.5℃批量培養(yǎng)(0.1%)，在連續(xù)黑暗中同時區(qū)分的兩種細胞A、B被光脈沖干擾，其中間發(fā)生在1.5小時或者7.0小時(分別對應于晝夜時間11.0或晝夜時間18.6)，接著發(fā)生細胞分裂(在晝夜時間12下降)。瞬態(tài)減弱后，振蕩器的τ值約為25.5小時。這種在相位節(jié)律(垂直虛線)和被預測(實線標記)節(jié)律之間的相位(ΔΦ)有區(qū)別，在它被干擾之前能夠被測量到，認為代表由光信號產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)ΔΦ。τ (25.5小時)值以前用于計算未干擾節(jié)律的相位，是由全部試驗獲得的合并均值。在相應梯級左邊給予的步長(ss，通常少于2個，表示不是每個細胞分裂都會被分開)，每個振蕩器的估計時間(τ，細胞分裂的連續(xù)發(fā)生間隔)表示1個周期。(摘自 Carré I, Oster AS, Laval-Martin DL et al.Curr Microbiol，1189，19:223-221.? Springer-Verlag.)圖3　細胞分裂的相位漂移不同步節(jié)律

在纖細裸藻無葉綠素ZC突變株的細胞分裂的不同步節(jié)律上，對于光信號(1900勒克斯)的重置操作，相位反應曲線(A)維持在連續(xù)黑暗中。穩(wěn)態(tài)相位漂移(±Δ)由1-h (·)產(chǎn)生和3-h(H)脈沖由如(圖3)描述所決定，向1小時規(guī)范化。結果是雙繪制的(開符號)，作為晝夜時間(以1小時為模)的功能 ，其中信號的中點是已經(jīng)給予。不連續(xù)性(“斷點”或“時相陡變”由虛線表示)是這種繪圖所固有的。在曲線B中，新合成的晝夜時間(’=±Δ)隨著干擾，由晝夜時間()的功能繪制，其中信號已經(jīng)給予，結果是平滑的正弦曲線。(摘自 Carré I, Oster AS, Laval-Martin DL, et al.Curr Microbiol，1189，19:223-221.? Springer-Verlag.)圖4　光合作用的晝夜節(jié)律

因此晝夜振蕩器在裸藻的細胞分裂周期控制中起到很重要的作用，作為其他真核細胞的代表。有絲分裂不是一個振蕩器重要的組成部分，但卻位于其下游。細胞分裂的阻斷不應讓這個系統(tǒng)停止振蕩[21,22]。因此細胞分裂會是潛在生物鐘的一只“手”。我們已經(jīng)用兩種方法在野生型中檢驗了這個假說：①如果不同步的分裂節(jié)律由于Vit B12原始水平低下而停止，而如果這種抑制隨后通過B12重新向媒介釋放，節(jié)律又能在未被干擾的控制中重新開始。②若給不同步的細胞以乳酸的脈沖，暫時加速細胞分裂周期和覆蓋晝夜振蕩器[13]，當補充的基質(zhì)被耗盡后，節(jié)律期最終恢復，節(jié)律期又處在平靜控制的階段。這些結果與之前發(fā)現(xiàn)的結果相符，因為通過向媒介加入含硫化合物，在連續(xù)光照里， P4ZUL突變體不同步的節(jié)律性同步恢復[15]。

在細胞媒介里自由氧濃度的規(guī)范數(shù)據(jù)，由12小時光照:12小時黑暗導引，然后釋放到連續(xù)光照里。(摘自Wolff D, Künne A.J Plant Physiol，2000，156:52-59.? Urban & Fischer Verlag.)圖5　裸藻無色突變株呼吸活動的晝夜節(jié)律

1.5無色裸藻突變株的呼吸活動光合作用的晝夜節(jié)律在纖細裸藻野生型Z培養(yǎng)物中已被報道[23]，其中媒介里的自由O2濃度用克拉克電極連續(xù)測量。中午產(chǎn)氧達峰值，節(jié)律在連續(xù)光照里持續(xù)至少8個周期，從而更早證實發(fā)現(xiàn)的結果[24,26]。這些數(shù)據(jù)被延伸到缺乏功能葉綠體的無色突變株[23]，但就這個株系，節(jié)律相位在野生型菌株中卻是相反的，在(人工的)黑夜，媒介中出現(xiàn)氧氣濃度的最高值(圖5)。突變株細胞的節(jié)律直接對更復雜的晝夜循環(huán)起反應，紅光(>518nm)和藍光(<550nm)在調(diào)節(jié)呼吸活動與給定的白光相比，如8小時光照:8小時黑暗(同步化這些細胞)同樣有效。因此，能量的需求要么由光合作用，要么由呼吸作用提供，取決于細胞的類型，這都是受光和晝夜節(jié)律生物鐘兩者的控制。光合作用節(jié)律的起源，可能位于與這兩個光合系統(tǒng)相關的光捕獲蛋白(LHCPs)的光誘導綜合體內(nèi)，這個綜合體受生物鐘控制，人工白天顯示增加高達20倍(見下面部分)[27]。

2.晝夜節(jié)律振蕩器與細胞周期生物鐘之間的耦合

我們已經(jīng)回顧了裸藻細胞分裂周期的生物鐘控制的證據(jù)(與其他微生物一樣)。這種“閥門效應器”現(xiàn)象反映的是晝夜振蕩器和細胞分裂周期之間的相互關系。如果不是作為振蕩器自身的一個要素，而是作為輸入輸出信號通路的連接環(huán)，這種耦合可受cAMP影響，在細胞分裂周期的調(diào)節(jié)和生物鐘功能中已經(jīng)涉及[18]。

真核細胞的細胞分裂周期是一個復雜的級聯(lián)事件，以細胞復制為頂點[28]。從一種調(diào)節(jié)狀態(tài)到另一種開始的這些轉變，是它們自身的反饋控制，決定細胞物理狀態(tài)的底物修飾。由遺傳和生化分析闡述的基本機制，已經(jīng)在以下生物體中保守，如酵母菌、非洲爪蟾蜍、蛤蚌、海星受精卵、培養(yǎng)的人類細胞和高等植物[29]。

兩個重要轉變控制點存在細胞分裂周期G1/S 和 G2/M邊界。M期被描述為激酶的激活(MPF，成熟促進因子，當注入爪蟾卵細胞時，以誘導細胞分裂的能力命名)，其中包含兩個組件子單元。一個是p34cdc2蛋白(S.非洲粟酒基因cdc2或同族體的產(chǎn)物，S.啤酒的CDC28)，其能使體內(nèi)的酪蛋白及組蛋白H1磷酸化和在有絲分裂有最大的激酶活性。另一個是細胞周期蛋白，其濃度在細胞分裂周期之間波動。它在細胞間期逐步地累積，形成p34cdc2復合體和激活蛋白激酶；在有絲分裂中降解，滅活激酶和MPF的活性。 因此，細胞周期蛋白-cdc2/CDC28 (MPF) 系統(tǒng)就像一個振蕩器或者“生物鐘”，在有絲分裂時重設到細胞間期和其似乎組成一個通用的細胞分裂循環(huán)的“引擎”[29]?，F(xiàn)在我們知道細胞周期蛋白的整個家族，p34cdc2周期性地把調(diào)節(jié)細胞分裂周期進程的蛋白激酶活性聯(lián)系起來造成連續(xù)波動，在植物和動物的細胞分裂周期中， cdc2關聯(lián)基因的確切種類得到不同表達。

2.1環(huán)腺苷酸(cAMP)的作用眾所周知，cAMP在細胞的調(diào)節(jié)中起著關鍵作用[30]，可影響晝夜振蕩器和p34cdc2——細胞周期蛋白通路之間的耦合，(可能和其他參與者一致)參與細胞分裂周期活動的閥門效應器到晝夜周期的特定相位。

甚至，cAMP 似乎有能力控制細胞分裂周期進程中某些限速步驟，刺激一些細胞的增值，但在其他細胞，卻有相反的效果，或一點效果都沒有[31,32]。在很多細胞類型中， cAMP的短暫增加與G1/S 和 G2/M邊界的細胞周期轉變有關。酵母菌的遺傳試驗和哺乳動物的藥學研究[30,33]已經(jīng)顯示，cAMP水平的一過性升高和接著下降，對于DNA的合成和MPF的誘導酪氨酸-脫磷酸作用激活的啟動是有必要的[34]，第二次cAMP劇增與完成相關，從有絲分裂中退出[35]。細胞分裂周期不同相位中，cAMP 濃度的相似變化已在裸藻中出現(xiàn)[36]。這些信號分別與p34cdc2-p60 (G1細胞周期蛋白)蛋白激酶復合物和p34cdc2-細胞周期蛋白B (有絲分裂細胞周期蛋白) 蛋白激酶復合物功能相一致。

因此，在動物和酵母菌中， cAMP 濃度波動代表細胞分裂周期進程，信號轉導的重要環(huán)節(jié)。在真核細胞里，AC信號通路的轉錄調(diào)節(jié)下刺激受cAMP-響應核因子家族調(diào)整。這些因子包含基本的結構域/亮氨酸拉鏈模序和cAMP-反應元件(CRE)二聚體。CRE-結合蛋白(CREB)的功能由cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化作用調(diào)整。

2.2環(huán)腺苷酸(cAMP)對細胞分裂節(jié)律的干擾如果周期性的信號在裸藻細胞分裂節(jié)律的產(chǎn)生中起作用，通過晝夜振蕩器，干擾或覆蓋cAMP水平的控制這一條件應該在下游活動中引起擾亂[18]。用了這種藥(圖6A)，依靠細胞分裂周期的相位，引起細胞分裂周期的縮短或加長，通過外源性cAMP，其振蕩的干擾導致了來自晝夜定時器細胞分裂周期的暫時解耦合。當在CT16 和 CT22之間給予cAMP時，能觀察到前進；當在CT03和 CT09之間給予cAMP時，能獲得下一個同步分裂步驟(相當于9小時)的延遲。在CT06-08和 CT18-20時獲得最大效應，相當于內(nèi)源性cAMP 水平是最低的時間。在晝夜時間已經(jīng)獲得細胞分裂周期的最大+ΔΦs 或者 -ΔΦs，也可得到計量反應曲線。僅僅1 nM cAMP足以干擾細胞分裂周期運輸。與細胞分裂周期的細胞周期蛋白生物鐘相比，不像可興奮組織，其cAMP的確能相位漂移信號輸出節(jié)律[37,38]，晝夜振蕩器不用通過添加cAMP來重置：分裂節(jié)律回到原始位相(圖6B)。

曲線來自17個單獨試驗。(A) 隨著cAMP 注入培養(yǎng)基，第一個細胞分裂步驟的前進或延遲。(B)干擾后， 穩(wěn)態(tài)ΔΦs 測量(有可能時)3～4天。開符號：cAMP 暴露1小時后，用新鮮的媒介稀釋細胞懸液50倍。實心符號：細胞沒有被稀釋。三角形, 500μM cAMP;圓圈, 250μM cAMP;正方形, 100μM cAMP.。(摘自:Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci，1913，30:403-1173.? 1913 The Company of Biologists, Ltd.)圖6　在裸藻無葉綠素ZC突變株中，通過cAMP，細胞分裂不同步節(jié)律干擾的相位反應曲線

隨著cAMP的注入，在生長曲線中觀察到的細胞分裂步驟ΔΦ ，反映細胞分裂周期進程速率的真實變化。通過流式細胞術測量細胞DNA含量提示[18]，在CT06-08注入cAMP 延遲穿過S期，可能穿過M期(圖7A)。若在CT18-20增加，cAMP 加速G2/M 過渡(圖7B)。細胞分裂節(jié)律的這些效應只是短暫的：48h后，和未干擾的控制一樣，分裂出現(xiàn)在相同的相位(圖6B)。

在連續(xù)黑暗同步分開的裸藻ZC突變株的細胞被分為兩個等份，其中一個接受cAMP (白色直方圖)，而另一個被用作質(zhì)控(黑色直方圖)。隨著波動，每4h收獲細胞，在70% 酒精中固定，RNAse A 處理，然后用碘化丙啶染色，立即先用熒光激活細胞分選儀(FACS)分析。(A)在CT06， cAMP的添加延遲細胞穿過S期的進程。 (B)在 CT20，cAMP 的添加刺激有絲分裂(注意在t=12h G2期峰值的減低)。自從向細胞媒介中加入cAMP，時間的消逝標示在相應直方圖的右側，而CT標示在左側。(摘自: Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci，1913，30:403-1173.? 1913 The Company of Biologists, Ltd.)圖7　細胞周期進程中cAMP的效應

通過檢測減小cAMP振蕩振幅的藥物效應，或者保持cAMP在某一水平，這樣所有cAMP的受體就能永久飽和，證明在細胞分裂周期進程中cAMP水平的內(nèi)源性晝夜節(jié)律變化有足夠的振幅產(chǎn)生類似的效應：我們希望這種藥用來阻止分裂節(jié)律性的表達。甚至AC的激活劑，cAMP類似物毛喉素使cAMP維持在異常的高水平[21]，連續(xù)黑暗里，增加不同步ZC突變株細胞，出現(xiàn)細胞群的快速失調(diào)和最終失去分裂節(jié)律性[18]。

這些發(fā)現(xiàn)指出，盡管裸藻中cAMP信號不重置晝夜振蕩器(因此cAMP不大可能代表生物鐘的“齒輪”)，但它們的確調(diào)節(jié)細胞分裂周期進程，從振蕩器作用下游——正如Zatz[39]所提出的小雞松果體細胞，可能存在并行通路。

2.3下游通路：環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴性蛋白激酶在振蕩的cAMP系統(tǒng)和細胞分裂周期之間，什么是連接環(huán)？根據(jù)應用時CT的通路，無論什么是細胞周期受到影響的調(diào)節(jié)通路，它必須能解釋相同信號是如何干擾不同的通路。一種可能性，是cAMP通過不同的“受體”表現(xiàn)為有選擇性地調(diào)整兩個調(diào)節(jié)通路中的一個或另一個。

我們已經(jīng)證明，裸藻ZC突變株包含cAMP依賴性蛋白激酶(cPKA和cPKB)兩個類型，對于cAMP和幾個cAMP類似物來說，它們有不同的密切關系[40]。發(fā)現(xiàn)細胞提取物包含兩個cAMP-結合蛋白，一個與cAMP有很高的親和力((Kd值為10nM和19nM)，一個能通過DEAE-纖維素色譜分析法分離。用肯普肽(激酶底物肽)作為底物(從哺乳動物細胞中，由cAMP依賴性激酶特異性磷酸化)分析蛋白激酶。用DEAE-纖維素色譜分析法部分提純cAMP后可觀察到激酶活性的刺激。分辨兩個活性的峰值相當于兩個不同的cAMP類似物特異性酶。因此， cAMP依賴性激酶類似于動物細胞，通過靶蛋白的磷酸化，植物細胞中的cAMP信息傳遞可繼續(xù)進行。

在細胞分裂周期進程的控制中，通過cAMP類似物提供工具給它們各自作用的研究，抽出裸藻中識別的兩個激酶的差異激活。我們斷定，cAMP 或 cAMP類似物的最小劑量可引起在人工白天或黑夜中分裂節(jié)律的ΔΦs[18]。在CT06-08和 CT18-20獲得的不同結果提示，由兩個不同的cAMP激酶來介導不同CTs 時cAMP 的效應。因此，選擇性激活cPKA 的8-芐氨基嘌呤- cAMP(8-BZA-cAMP)在CT06-08增加時,誘導-ΔΦs，但在CT18-20時沒有效應。相反地，特異激活cPKB的8-(4-硫代氯苯基)-cAMP(8-CPT-cAMP)在CT18-20增加時，誘導+ΔΦs和分裂節(jié)律性的減少，但在CT06-08增加時，不干擾分裂節(jié)律。

cAMP, 8-BZA-cAMP, 8-CPT cAMP與6-MBT-cAMP的劑量之間也有關聯(lián)，引起在CT06-08時細胞分裂周期和cPKA類似物 Ka值的干擾，結果提示cPKA在這些CTs時，介導cAMP的延遲效應。同樣地，相同核苷酸的劑量之間也有關聯(lián)，引起在CT18-20時細胞分裂周期和cPKB類似物Ka值的干擾，結果表明在CT18-20時cPKB介導cAMP的加速效應。這些發(fā)現(xiàn)簡單的解釋是這些激酶是在細胞分裂周期不同階段表達，在哺乳動物細胞中，被描述為Ⅰ型和Ⅱ型cAMP依賴性激酶。

3.小結

藻類比如纖細裸藻已經(jīng)作為試驗模型，被用來了解晝夜節(jié)律記時的作用機制，已經(jīng)超過了半個世紀，是因為它們方便利用，易于測量其生理特征以反映晝夜節(jié)律的輸出信號。 另外，藻類的代謝輪廓分析日益重要，因為它們能提供豐富多樣的化合物，對于食品、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、生物燃料和公共衛(wèi)生等方面具有很大潛在的經(jīng)濟價值[41]。 生物鐘使裸藻能維持近似1小時的晝夜節(jié)律，其主要通過接受光信號，經(jīng)過一系列的信號轉導途徑，在晝夜振蕩器中不斷地產(chǎn)生振蕩，最后通過輸出途徑控制基因的節(jié)律性表達等；但仍存在局限性：高通量組學篩查經(jīng)常遇到的問題是只能鑒別基因和蛋白，而不能知道其功能。很多的功能分析會降低相關信息量，比如在晝夜時間的系列研究中，由于不完善的注釋而很少使用。通過對裸藻晝夜節(jié)律深入的研究，對揭示生物鐘的本質(zhì)、生物進化的分子機制等具有重要意義，可為各種動植物包括人類的生產(chǎn)實踐與醫(yī)療保健等方面提供可靠的理論依據(jù)。

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作者單位：1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗科530021

基金項目：國家自然科學基金(8321120527，81370265，8147108, 81400710)；衛(wèi)生部公益性研究基金(201192008)；

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.002

收稿日期：2015-6-20

The survey of relation with aging degenerative changes and biont in circadian clock pattern(HEBenjin1,2,LIANGQinghua1,HUCaiyou1,SUNLiang2,ZHUXiaoquan2,YUANHuiping2,YANGFan2,LIXinghui2,QINJiaoqin1,2,JIAChunyuan2,HANJing2,DUJiancai2,ZHANGFandi2,YANGZe2.1.Departmentofclinicallaboratory,Jiangbinhospital,Nanning,Guangxi519021,China.2.InstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,BeijingHospital,Beijing100719,China)*Correspondingauthor:LIANGqinghua,HUcaiyou.

【Abstract】In the natural environment,circadian clock in organism receives the periodic signal of light and darkness outside, adjust the phase itself, and synchronize ambient.Circadian clock controls circadian rhythms,which has the characteristics of endogenous and self sustaining running.We review that the decisive element of circadian clock, the mechanism of circadian clock and circadian rhythm are futher analyzed by the change of physiological and biochemical levels in wild-type strain and mutant of Euglena gracilis,as well as the relation with aging degenerative changes and biont in circadian clock pattern.

【Key words】circadian clock, circadian rhythm,cell division cycle, Euglena gracilis Klebs

※為通訊作者