南極海泥來源抗腫瘤真菌的篩選與鑒定

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009）

海洋微生物由于資源豐富，在解決用藥需求問題的同時具有不破壞生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點，其生物活性物質(zhì)的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點［1］。特別是海洋真菌因其代謝途徑復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類繁多而日益受到研究者的重視［2］，是開發(fā)抗腫瘤及其它藥物的重要資源。海洋真菌次級代謝產(chǎn)物因新穎的骨架結(jié)構(gòu)而具有生物活性的多樣性［3］，其抗氧化性、抗菌、抗酪氨酸酶、細胞毒活性或抗腫瘤、醌還原酶誘導(dǎo)和抗瘧原蟲活性也被廣泛研究［4］。目前，已從海洋環(huán)境中分離得到多種具有較強細胞毒活性和抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，僅2006～2012年間，就從海洋真菌中分離得到了690個天然產(chǎn)物［4］，其中大多數(shù)化合物屬于聚酮類，其次為生物堿、萜類以及肽類。這些海洋真菌多屬于青霉屬和曲霉屬，還有不常見的頂頭胞屬、裸胞殼菌屬、附球菌屬等。雖然從海洋真菌中分離的抗癌先導(dǎo)化合物進入人體臨床試驗的數(shù)量大幅增加［5］，但這些先導(dǎo)化合物由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成難度較大，難以滿足臨床需求［6］。

作者在此對61株分離自南極海泥的海洋真菌進行抗腫瘤活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有潛在應(yīng)用前景的抗腫瘤活性菌株，并為活性物質(zhì)的分離奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

海泥樣品取自南極深海，保存于中國藥科大學(xué)微生物制藥實驗室。

MTT（噻唑藍），Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胎牛血清，Giboco公司；二甲基亞砜、乙酸乙酯，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；真菌基因組DNA 提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司；Taq酶，上海生物工程公司；PCR 引物由上海生物工程公司合成。

SHZ－D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵、HH－S型水浴鍋，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；BS1245型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限責(zé)任公司；DHG－9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科有限公司；CO2培養(yǎng)箱，Excella公司；酶標儀，BIO－TEK 公司；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SW－CJ－2FD 型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；凝膠成像系統(tǒng)，Bio－Rad公司。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（取200g馬鈴薯，煮沸30min，5～8層紗布過濾，濾液補足至1 000mL）中加入葡萄糖1.6%、瓊脂2%、海鹽1.6%，混合后加入200mg氯霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，可溶性淀粉2%，酵母粉1%，KH2PO42%，海鹽2%，MgSO4·7H2O 0.6%。

細胞培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和1%的雙抗。

1.3 腫瘤細胞株

人肝癌HepG－2細胞；人胃癌7901細胞；人結(jié)腸癌116細胞。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離

采用平板稀釋法，取海泥樣品1g，加無菌水10 mL，激烈振蕩制備混懸液，逐步稀釋制成10－1～10－7梯度溶液，分別涂布于分離平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)。觀察菌落的形態(tài)，挑取形態(tài)大小差異較大的菌落，純化后4 ℃冰箱保存。

1.4.2 乙酸乙酯萃取物的制備

將純化后的菌體由斜面接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、200r·min－1培養(yǎng)7d，發(fā)酵液去除菌絲體，用等體積乙酸乙酯萃取3次，上層有機相于45℃減壓濃縮至干，用二甲基亞砜溶解配制成100μg·mL－1的粗品并用0.22μm 微孔濾膜過濾供活性測試。

1.4.3 抗腫瘤活性菌株的篩選

采用MTT 法［7］測試乙酸乙酯萃取物的體外抗腫瘤活性。取對數(shù)生長期的細胞，用細胞消化液消化并收集細胞，吹打混勻，記數(shù)，配制成5×104個·mL－1的細胞懸液。按每孔180μL 接種于96孔板，并設(shè)置陰性對照和空白對照。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加入20μL稀釋的乙酸乙酯萃取物，每個濃度設(shè)置5 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)20h。每孔加入20μL MTT，反應(yīng)4h后取出，吸去上清液，加入150μL 二甲基亞砜溶液，用酶標儀測定590nm 處吸光度，按下式計算抑制率。

1.4.4 活性菌株的鑒定

取適量發(fā)酵液，離心，去上清液，將菌絲體在液氮中充分研磨后轉(zhuǎn)入2 mL EP 管中，用真菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 后，采用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）擴增提取的rDNA ITS基因。PCR 反應(yīng)體系為50μL：模板DNA 5μL、引物ITS1和引物ITS4各1μL、dNTP mixture（2.5mmol·L－1）4μL、10×PCR buffer 5μL、Taq酶5μL；ddH2O 33.5μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，33個循環(huán)；72 ℃延伸3min。

PCR 擴增產(chǎn)物的檢測：取5μL 擴增產(chǎn)物加1μL 6×上樣緩沖溶液，于含溴化乙啶的1% 瓊脂糖凝膠上100V 電泳30min，在紫外燈下觀察純化結(jié)果。對純化后產(chǎn)物測序，并與GenBank中已知序列進行比對，以鑒定抗腫瘤活性菌株的歸屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗腫瘤活性菌株的初篩

采用MTT 法對分離得到的61株海洋真菌進行活性初篩。分別測定100 μg·mL－1海洋真菌對HepG－2細胞、7901細胞及116細胞的抑制率，結(jié)果見表1。

由表1可知：有27株菌對HepG－2細胞抑制率大于60%，占總供試菌株的44.26%；有22株菌對7901細胞具有抑制作用，占總供試菌株的36.07%；有22株菌對116 細胞抑制率大于50%，占總供試菌株的36.07%。

2.2 抗腫瘤活性菌株的復(fù)篩

為進一步驗證活性菌株的抗腫瘤活性，采用倍比稀釋法將初篩中具有較高抗腫瘤活性的9株菌株濃度（μg·mL－1）分別稀釋為50、25、12.5、6.25，通過MTT 法測定其在不同濃度下對HepG－2細胞的抑制率，并計算IC50值，結(jié)果見表2。

由表2可知，菌株S33、S45發(fā)酵液的濃度稀釋到6.25μg·mL－1時，抗腫瘤活性仍然很高。于是，又將其濃度（μg·mL－1）稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株S33和S45仍具有很高的抗腫瘤活性，其IC50值分別為3.53μg·mL－1和1.25μg·mL－1。

2.3 抗腫瘤活性菌株的鑒定

對具有較高抗腫瘤活性的菌株S3、S26、S33、S45、S48、S50、S58進行測序，并與GenBank中已知序列進行比對，結(jié)果見表3。

由表3 可知，菌株S3 屬黑附球菌屬，菌株S26、S50屬曲霉屬，菌株S33、S45屬青霉屬，菌株S48屬藍狀菌屬，菌株S58屬交鏈孢真菌屬。

3 結(jié)論

從南極海泥樣品中分離得到61株海洋真菌，先采用MTT 法對其發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物進行體外抗腫瘤活性篩選，然后對活性較高的菌株進行鑒定，并進一步測定乙酸乙酯萃取物對HepG－2細胞的IC50值。結(jié)果表明：對HepG－2細胞抑制率大于60%的有29株菌，占總供試菌株的47.54%；對7901 細胞具有抑制作用的有22 株菌，占總供試菌株的36.07%；對116細胞抑制率大于50%的有22株菌，占總供試菌株的36.07%；菌株S45的抗腫瘤活性最強，對HepG－2細胞的IC50值為1.25μg·mL－1，經(jīng)鑒定為青霉屬真菌。

表1 抗腫瘤活性菌株對HepG－2細胞、7901細胞及116細胞的抑制率／%Tab.1 Inhibition rate of antitumor active strains against cell HepG－2，cell 7901and cell 116／%

表2 抗腫瘤活性菌株對HepG－2細胞的抑制率及IC50值Tab.2 Inhibition rate and IC50value of antitumor active strains against cell HepG－2

表3 抗腫瘤活性菌株的鑒定Tab.3 Identification of antitumor active strains

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