金銀花耐缺氧活性部位的HPLC指紋圖譜研究

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110122）

金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，性寒味甘，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱的功效，為臨床常用中藥之一［1－3］，主要含有環(huán)烯醚萜類［4］、有機(jī)酸類［5］、黃酮類［6］等化學(xué)成分。在研究金銀花防治心血管疾病活性成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，金銀花藥材經(jīng)水提醇沉、D101大孔吸附樹(shù)脂梯度洗脫，所得的30%乙醇－水洗脫部位能夠延長(zhǎng)異丙腎上腺素攻擊后小鼠缺氧存活時(shí)間，提示其為金銀花提高小鼠心肌細(xì)胞耐缺氧能力的活性部位。對(duì)活性部位的進(jìn)一步研究表明，其中的咖啡酰奎寧酸類成分具有較好的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道的金銀花指紋圖譜多集中于對(duì)藥材提取物和抗炎活性部位的研究，未見(jiàn)防治心血管疾病相關(guān)活性部位的HPLC 指紋圖譜研究。

鑒于此，作者采用HPLC 法，以咖啡?？鼘幩犷惓煞值淖畲笪詹ㄩL(zhǎng)330nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)收集的10批金銀花藥材的耐缺氧活性部位HPLC 圖譜進(jìn)行分析比較，建立指紋圖譜共有模式，為金銀花防治心血管疾病相關(guān)活性部位入藥提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

10批產(chǎn)地分別為山東、河南、河北的金銀花藥材（批號(hào)分別為：100902，100903，100906，100910，100912，100913，100916，100917，100918，100920）。

對(duì)照品：綠原酸（批號(hào)：110753－200413），中國(guó)藥品生物制品檢定所；反式咖啡酸、3，4－二咖啡?？鼘幩帷?，5－二咖啡?？鼘幩?、4，5－二咖啡?？鼘幩幔ń?jīng)核磁共振波譜和質(zhì)譜鑒定，采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法檢測(cè)，純度均大于98%），自制。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、95%乙醇（分析純），山東禹王有限公司；三氟乙酸（TFA，色譜純），北京迪馬科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；D101大孔吸附樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠。

Agilent 1200分析型高效液相色譜儀（包括四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、DAD 檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器），美國(guó)Agilent公司；BT124S型電子天平，北京賽多利斯有限公司；FDU－1200型冷凍干燥機(jī)，東京理化器械株式會(huì)社；ZDHW 型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：分析型Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量15μL；柱溫30 ℃；流速1.0mL·min－1；梯度洗脫60min。線性梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品混合溶液的配制

表1 線性梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

取綠原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡?？鼘幩?、3，5－二咖啡?？鼘幩帷?，5－二咖啡?？鼘幩釋?duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成綠原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡?？鼘幩?、3，5－二咖啡?？鼘幩?、4，5－二咖啡?？鼘幩釢舛龋╩mol·L－1）分別為0.240、0.268、0.071、0.089、0.108的對(duì)照品混合溶液。

1.3.2 活性部位供試品溶液的制備

取金銀花干燥藥材50g，加入400 mL 水浸泡過(guò)夜，加熱回流提取2次，每次3h，合并提取液，減壓濃縮至50mL，邊攪拌邊加入95%乙醇150mL，靜置過(guò)夜，抽濾，將濾液濃縮至無(wú)醇味，濃縮液經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂柱色譜分離，乙醇－水梯度洗脫，收集30%乙醇－水洗脫部位，濃縮，凍干，得到凍干粉。取凍干粉約20mg，精密稱定，溶于50%甲醇中，定容至5 mL，搖勻，即得活性部位供試品溶液。

1.3.3 測(cè)試方法

將10批產(chǎn)地不同的金銀花藥材按1.3.2方法制備活性部位供試品溶液，按1.3.1方法配制對(duì)照品混合溶液。精密量取對(duì)照品混合溶液和活性部位供試品溶液各15μL，按色譜條件測(cè)定高效液相色譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為100902的藥材凍干粉，制備活性部位供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為100902的藥材凍干粉，制備活性部位供試品溶液，分別在制備后0h、4h、8h、12h、16h、24h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別稱取批號(hào)為100902的藥材凍干粉6份，制備活性部位供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以綠原酸的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明重復(fù)性良好。

2.1.4 檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

2倍時(shí)間色譜圖中1h 以后沒(méi)有色譜峰，說(shuō)明樣品出峰完全。

2.2 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.2.1 指紋圖譜的選擇及特征峰的標(biāo)定

采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，其中色譜峰2（綠原酸）分離度良好，峰位居中，峰面積較大而且穩(wěn)定。因此，選取綠原酸為參照峰（S），將其余指紋峰的保留時(shí)間與同一圖譜中的參照峰（設(shè)定為1）進(jìn)行比較，其比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間。通過(guò)色譜圖的疊加比較，得到10 批金銀花活性部位的8 個(gè)共有峰，如圖1所示。

圖1 10批金銀花活性部位的高效液相色譜疊加圖Fig.1 HPLC Overlapping chromatograms for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae

通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照，指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰分別為：綠原酸（S峰）、反式咖啡酸（4號(hào)峰）、3，4－二咖啡?？鼘幩幔?號(hào)峰）、3，5－二咖啡酰奎寧酸（7號(hào)峰）、4，5－二咖啡?？鼘幩幔?號(hào)峰），如圖2所示。

利用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件（2010版）”處理，得到金銀花活性部位的指紋圖譜，如圖3所示。

2.2.2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積（表2）

2.2.3 非共有峰面積

計(jì)算了10批供試品溶液指紋圖譜中非共有峰面積及占總峰面積的百分比。結(jié)果顯示，非共有峰的峰面積占總峰面積的百分比小于10%，符合指紋圖譜有關(guān)要求。

圖2 混合對(duì)照品溶液的高效液相色譜Fig.2 HPLC Chromatograms of the mixing solution of reference substances

圖3 金銀花活性部位的指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of active fraction from Flos Lonicerae

表2 10批金銀花活性部位指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積Tab.2 Relative retention time and relative areas of common peaks for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae in fingerprint

2.2.4 金銀花藥材指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)（表3）

由表3可知，金銀花藥材指紋圖譜的相似度均大于0.98。說(shuō)明這10批金銀花藥材的化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3 討論

2.3.1 色譜柱的選擇

考察了Phenomenex Gemini C18（250mm×4.60 mm，5μm）、YMC－Pack ODS－A（250mm×4.60mm，5μm）、Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60mm，5μm）3 種不同型號(hào)色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，3種色譜柱的分離度相差不大，Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60mm，5 μm）的峰形更尖銳一些，不易拖尾。因此，選用Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60 mm，5μm）作為色譜柱。

表3 10批金銀花指紋圖譜的相似度分析Tab.3 Similarity analysis of fingerprints for 10 batches of Flos Lonicerae

2.3.2 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相的篩選中，嘗試等濃度洗脫的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等濃度洗脫分離時(shí)間較長(zhǎng)，分離效果遠(yuǎn)不及梯度洗脫，故選用梯度洗脫。

分別選用甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.5‰TFA 水溶液、乙腈－0.5‰TFA 水溶液4種體系作為流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作流動(dòng)相時(shí)，各峰分離度較好，且基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析?？赡苁怯捎诮M分中含有咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)，具有一定的酸性，需在流動(dòng)相中加入少量的酸，從而改善各色譜峰之間的分離度。因此，選用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作為流動(dòng)相。

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

研究表明，咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)具有較好的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，因此，以咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)330nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，能使活性成分得到充分體現(xiàn)，且分離度較好。在其它波長(zhǎng)下，咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)吸收值較小，而且受其它成分峰的干擾，分離度不好。因此，選用330nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3 結(jié)論

采用水提醇沉、D101大孔吸附樹(shù)脂梯度洗脫，富集金銀花中提高小鼠心肌細(xì)胞耐缺氧能力的活性部位，建立了HPLC測(cè)定金銀花耐缺氧活性部位指紋圖譜的方法，以咖啡?？鼘幩犷愇镔|(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)330nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)收集的10批金銀花藥材的耐缺氧活性部位HPLC圖譜進(jìn)行分析比較，建立指紋圖譜共有模式，對(duì)其中的共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，為金銀花防治心血管疾病相關(guān)活性部位入藥提供質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)。

［1］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上冊(cè).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：1403－1405.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：205－206.

［3］宋衛(wèi)霞.金銀花水溶性化學(xué)成分研究［D］.咸陽(yáng)：陜西中醫(yī)學(xué)院，2008.

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