牛GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR基因遺傳變異與多胎性狀的關(guān)聯(lián)性研究

游 偉，劉桂芬,成海建,劉曉牧，姚玉妮，宋恩亮*

（1.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100）

能繁母牛存欄水平下降給肉牛產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展帶來不利影響，造成市場上架子牛和犢牛貨源緊缺，而同時母牛低繁殖率制約了養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，使得提高牛的繁殖率成為國內(nèi)外養(yǎng)牛業(yè)研究的熱點課題。母牛生雙胎或多胎是復(fù)雜的性狀，受遺傳和環(huán)境[1]兩方面因素的影響。排卵數(shù)決定了生雙胎或多胎，從表型上看屬于數(shù)量性狀或閾性狀，從微觀上看，受基因調(diào)控。排卵數(shù)受排卵前卵泡數(shù)量和質(zhì)量的影響，卵泡發(fā)育決定母牛的排卵數(shù)和胎產(chǎn)數(shù)，最終影響母牛的繁殖性能。

牛雙胎具有它的遺傳性，可通過遺傳選育來提高雙胎率，為了提高牛的雙胎率研究者已進行了大量的研究與探索，國內(nèi)對雙胎的研究主要集中在關(guān)聯(lián)性研究方面[2-6]，至今其遺傳機制仍不清楚。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多激素、細胞因子和粘附因子通過內(nèi)分泌活動與排卵聯(lián)系起來，在卵泡發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮著非常重要的作用，如：促黃體素 （Luteotropic hormone，LH）、促卵泡素 （Follicle stimulating hormone,FSH）[7,8]、 促卵泡素受體 （Follicle stimulating hormone receptors,FSHR）[9,10]、 生長和分化因子-9（Growth different-Ⅰation factor-9,GDF-9）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 15（Bone morphogenetic protein-15,BMP-15）[11-13]等。卵母細胞在調(diào)節(jié)和促進卵泡的生長中具有重要的作用，其所產(chǎn)生的生長因子主要通過旁分泌信號作用于顆粒細胞。小鼠的基因研究表明，GDF9和BMP15是卵母細胞來源的生長因子，其關(guān)鍵作用在卵巢功能的調(diào)節(jié)、排卵率和生育率[14,15]。GDF和BMP15是與哺乳動物卵母細胞分泌蛋白質(zhì)相關(guān)的是正常生育必不可少的兩種因子，這兩個基因的大量突變已被證明與卵巢早衰和異卵雙生[12]以及增加排卵率有關(guān)[16]。在雌性小鼠卵泡發(fā)育早期GDF9基因功能喪失，將導(dǎo)致不孕不育[17]。在綿羊中，GDF9和BMP15的突變的影響敏感的拷貝數(shù)。這兩個基因的雜合突變增加雙胞胎的頻率倍數(shù)，而純合突變導(dǎo)致卵巢發(fā)育不全和不育[13,18]。這兩種因子對不同物種成功繁殖有不同程度的影響，如小鼠敲除BMP15基因表現(xiàn)出輕度降低生育率[19]，而羊BMP15基因的純合子突變形式是不育的[18,20]。在人類這兩種蛋白的異常表達都參與了卵巢早衰、孿生[21]等生殖功能。

受以上研究結(jié)果啟示，結(jié)合試驗牛生雙胞胎家系遺傳性，對下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)相關(guān)的功能基因：GDF9、BMP15、FSHβ、FSHR基因進行多態(tài)性分析，找到八頭生雙胎牛的共同突變位點。分析在產(chǎn)雙胎牛和產(chǎn)單胎牛群體中對與生殖軸相關(guān)的激素水平（GH、LH、FSH、P4）的分布水平，從而了解激素對單胎妊娠和雙胎妊娠的意義以及基因突變對性激素分泌的影響，進而為產(chǎn)雙胎牛繁殖性狀產(chǎn)生影響的分子機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

在山東省魯西牛原種場采集到具有血緣關(guān)系的生過雙胎的魯西母牛的血液樣本共8份，以及單胎魯西母牛血樣60頭份。全部采用頸靜脈采血，用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

本實驗設(shè)計GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR引物，擴增出上述四種基因的全部外顯子區(qū)。引物序列及產(chǎn)物大小及退火溫度見表1。

表1 GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR四種基因引物序列、產(chǎn)物大小及退火溫度

引物名稱 基因座 引物序列 退火溫度（℃） 片段大?。╞p）FSHR-E11-1F FSHR-E11-1R FSHR-E11-2R FSHR-E11-2R FSHβ-E1F FSHβ-E1R FSHβ-E2F FSHβ-E2R FSHβ-E3-1F FSHβ-E3-1R FSHβ-E3-2F FSHβ-E3-2R BMP15-E1-F BMP15-E1-R BMP15-E2-1F BMP15-E2-1R BMP15-E2-2F BMP15-E2-2R GDF9-1F GDF9-1R GDF9-2-1F GDF9-2-1R GDF9-2-2F GDF9-2-2R GDF9-2-3F GDF9-2-3R E11-1 E11-2 E1 E2 E3-1 E3-2 E1 E2-1 E2-2 E1 E2-1 E2-2 E2-3 5'-ACTCCAAGCATAATTCCTGTTCTG-3'5'-AAGTTGTGGACCAAGTACTC-3'5'-GCTCTCAGTCTACACTCTGACCG-3'5'-ACTCCAAGCATAATTCCTGTTCTG-3'5'-TTATTTGTCCCGATCTACTGCG-3'5'-ATTTCAGAGGCCAGATGAATTG-3'5'-TGCTGGAGCAAAATATGATAAGAG-3'5'-CAAATCTGAGCCCAAACATTTAG-3'5'-CTGTAAACATTAGAGCGAGCAGT-3'5'-AGAGTTTTATCCTGTCTCCATCC-3'5'-CCTCAAAGCCTAACACTCCACAT-3'5'-AGTGACCCAAAATTTAAACGAGG-3'5'-CTTTTGTGGTAGTGGAGCCT-3'5'-ACACTTTTCTTCCCCATTTT-3'5'-AGGGCTGCTTGTCAGTTTGT-3'5'-ATGGCATGATTGGGAGAATT-3'5'-CTCGTCAAGCAGGCAGTATT-3'5'-ACTGTCTTCACCCCAAACCT-3'5'-ATTACAGAAGTGAACCTAGCCCA-3'5'-GCAAGGGCCAACTCCTTTAT-3'5'-CCACCCTGACGTTTAAGGCT-3'5'-CAGATTGAATGAAGCTGGAA-3'5'-GTGCTCAGGCTTTTCACAGG-3'5'-GAAACTTCCTCCCAAAGGCA-3'5'-ATCGAGCCTGATGGCTCAAT-3'5'-GCTTTTAGACACACTCCCTCTCC-3'54.4 51.9 59.7 56.9 55.8 54.2 55 54.1 56.5 55 58.2 55.2 56.1 56.5 57.2 56.7 55.5 55.7 56.8 55.1 56.9 50.6 56.4 54.9 56.2 58.3 401 1061 422 471 981 980 498 794 649 608 743 632 547

1.2.2 基因測序和血清激素水平檢測

對雙胎牛和單胎牛個體血樣的PCR擴增產(chǎn)物送交山東省農(nóng)科院測序中心直接在ABI3730自動測序儀上測序。血清樣本送交北京北方生物技術(shù)研究所直接在XH6080放免儀器上采用放射免疫的方法檢測血清激素水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GDF9、BMP15、FSHβ和FSHR基因外顯子區(qū)序列結(jié)果

對GDF9、BMP15、FSHβ、FSHR基因的全部外顯子區(qū)序列進行測定，測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GDF9、FSHβ和FSHR基因的外顯子區(qū)域，共找到7處突變位點，分別命名為GDF9-A99G、GDF9-G121A、FSHβ-C1126T、FSHβ-G1138A、FSHR-G1109C、FSHR-G1153A 和 FSHR-A1327T，其中在 GDF9和 FSHβ中所發(fā)現(xiàn)的突變位點在單胎牛和雙胎牛中均有發(fā)現(xiàn)，而在FSHR基因的第11外顯子共找到三處8頭產(chǎn)雙胎牛共同的突變位點。針對三個突變位點設(shè)計兩對引物（引物P1 F：5’-AAGATCCTCCTGGTCCTGTT-3’，R：5’-ATTGGAACCATTAGTAACCCT-3’； 引物 P2 F：5’-CACAACTATGCCATCGACTGG-3’，R：5’-ACATTGAGCACAAGGAGGGAC-3’）在產(chǎn)單胎牛群中進行檢測。共檢測到三處共同的突變位點FSHRG1109C、FSHR-G1153A和FSHR-A1327T。FSHR-P1和FSHR-P2基因座在產(chǎn)雙胎牛和產(chǎn)單胎牛中共表現(xiàn)出的基因型如圖1、圖2、圖3、圖4所示。（圖1、圖3中泳道1-8為雙胎牛，其余為單胎牛）。

圖1 FSHR基因引物FSHR-P1擴增序列的SSCP電泳圖

圖2 FSHR基因引物FSHR-P1 SNPs的測序結(jié)果(A為單胎牛，B為雙胎牛)

圖3 FSHR基因引物FSHR-P2擴增序列的SSCP電泳圖

圖4 FSHR基因引物FSHR-P2 SNPs的測序結(jié)果(A為單胎牛，B為雙胎牛)

2.2 上胎產(chǎn)單胎母牛和產(chǎn)雙胎母牛血清學(xué)激素水平

雙胎牛與單胎牛GH、LH、FSH、P4最小二乘均值差異顯著性檢驗結(jié)果顯示，雙胎與單胎水平比較差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.148、0.331、0.090、0.058)，除P4激素單胎牛較雙胎牛略高外，產(chǎn)雙胎牛孕前血清學(xué)GH、LH、FSH這3種激素水平高于產(chǎn)單胎牛，且比產(chǎn)單胎牛高出近2倍接近（表2）。

表2 雙胎牛和單胎牛血清中GH、LH、FSH、P檢測分析

3 討論

3.1 牛FSHR基因多態(tài)性及其在產(chǎn)單、雙胎牛群體中的分布

Xiaoyu Huang等研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓的FSHβ基因的A213T，A91G和A89C3堿基發(fā)生替換且A213T替代導(dǎo)致1個氨基酸突變（賴氨酸→蛋氨酸），大熊貓A等位基因與B等位基因相比有更好的產(chǎn)仔性狀[22]。FSHβ基因誘導(dǎo)GDF9和促性腺激素釋放激素的協(xié)同作用。Chu等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因的單核苷酸多態(tài)性在兩個高繁殖力羊品種（小尾寒羊和湖羊）和兩個低繁殖力綿羊品種（考力代和中國美利奴羊）中分布明顯不同[23]。FSHR基因編碼產(chǎn)物為疏水性跨膜蛋白，具有明顯的信號肽，其切割位點位于17-18位的氨基酸之間，二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主，并主要在質(zhì)膜中發(fā)揮生物學(xué)作用，跨膜區(qū)域分為跨膜域、胞外域和胞內(nèi)域3個部分序列分析表明，F(xiàn)SHR編碼產(chǎn)物可能具有離子通道、運載體、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和陽離子通道等功能，在離子跨膜與信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用，并對黃牛的激素調(diào)節(jié)有影響。本研究所發(fā)現(xiàn)的FSHR-G1109C、FSHR-G1153A和FSHR-A1327T三處突變點在雙胎牛中分別以CC、AA、TT純合子的形式存在，在產(chǎn)單胎群體中只有2個產(chǎn)單胎牛個體在1109處是以GC雜合子的形式存在的，其它個體都是以GG的純合子形式存在，突變率僅為0.03%。因此，雙胎牛和單胎牛二者之間FSHR基因的第11個外顯子的突變率差異很大，且三處突變位點都在編碼區(qū)，可能對激素的調(diào)節(jié)產(chǎn)生作用，從而影響黃牛的排卵率。而GDF9-A99G、GDF9-G121A、FSHβ-C1126T和FSHβ-G1138A四處突變位點在雙胎牛和單胎牛中均有發(fā)現(xiàn)。表明在產(chǎn)雙胎的性狀中FSHR的三處突變位點起著主導(dǎo)作用，F(xiàn)SHβ基因誘導(dǎo)GDF9和促性腺激素釋放激素的協(xié)同作用，可能控制FSH、LH、P4、GH的活性，與牛產(chǎn)雙胎的繁殖性狀有一定關(guān)系，對增加生雙胎的幾率、提高牛的繁殖率有一定的可能性。

3.2 上胎產(chǎn)單、雙胎母牛血清學(xué)激素水平的分布規(guī)律

Lazaros等對FSHR的T307A不同基因型分析顯示，該突變能夠降低血清FSH水平，提高卵泡和卵母細胞的數(shù)量，增加大卵泡數(shù)量[24,25]。GDF9和BMP15 mRNA的表達水平在體外成熟水牛卵母細胞的過程中變化并且被認為是依賴促性腺素（FSH和LH）[26]。排卵卵泡的數(shù)量與復(fù)雜的內(nèi)分泌和旁分泌途徑的調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。其中一個重要的機制就是卵巢的TGF信號通路。GDF9和BMP15的卵母細胞的分泌是正常的人類生育必要和在確定卵泡發(fā)育和排卵率發(fā)揮重要作用。BMP-15是通過抑制FSH受體表達來抑制FSH信號傳導(dǎo)[27]。FSH和LH及其受體的表達對卵泡能否成功選擇起決定性作用[28,29]。FSH和LH濃度的相對變化、引起刺激反應(yīng)的激素濃度閾值和卵泡同期化發(fā)育程度。在高濃度的FSH作用下，大量卵泡快速生長發(fā)育，進入選擇階段。本研究中，雙胎牛的孕前GH、LH、FSH三種激素水平高于產(chǎn)單胎牛，且與產(chǎn)單胎牛2倍接近。這可能是由于GDF9、FSHβ及FSHR基因發(fā)生突變可能導(dǎo)致蛋白表達活性和結(jié)合能力的改變，使卵泡選擇調(diào)控作用增強，排卵率增加?？赡艿恼{(diào)控途徑主要包括：FSHβ、GDF9和FSHR基因突變后，增強了FSH的表達量及其與受體的結(jié)合能力，使血液中FSH濃度有所增加，延長了其在閾值以上的作用時間，使更多的卵泡能夠發(fā)育到LH依賴型；降低卵泡生長發(fā)育所需要的FSH最低濃度，這樣可以使部分卵泡在較低的FSH濃度下可以接受刺激而生長，產(chǎn)生更多的LH受體，能過渡到LH依賴期；在較高濃度的FSH和LH聯(lián)合作用下，卵泡同期化發(fā)育程度提高，在同一發(fā)情周期中，同步發(fā)育的卵泡數(shù)目增多。

本研究中雙胎樣本例數(shù)較少，有必要綜合雙胎妊娠的孕期指標，了解雙胎妊娠母牛與單胎妊娠母牛GH、LH、FSH、P4水平的差別的基礎(chǔ)上聯(lián)合基因標記，進一步驗證和研究，并完善產(chǎn)前和產(chǎn)后檢測和數(shù)據(jù)匯總，進一步指導(dǎo)肉牛多產(chǎn)性的選育，將對提高牛的繁殖率具有重大意義。

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