龍眼胚性愈傷組織中TFL1基因克隆及其表達分析

陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州350002）

TFL1（TERMINAL FLOWER 1）是花序分生組織特異基因[1]，與 FT（FLOWERING LOCUS T）、MFT（MOTHER OF FT AND TFL1）構成FT/TFL1基因家族的3個亞家族，具有保守的磷脂酰乙醇胺結合域（PEBP結構域）[2-3]。TFL1是開花抑制基因[4]，擬南芥tfl1突變體的開花時間提早，花序分生組織轉變?yōu)榛ǚ稚M織，在頂端開花[5]；超量表達TFL1基因導致擬南芥營養(yǎng)生長和花序生長都延長，開花時間推遲[6]。Wigge等[7]研究表明，TFL1基因通過營養(yǎng)生長階段低水平表達延長植物的營養(yǎng)生長，通過在花序分生組織中大量表達來維持花序的無限生長，從而抑制花分生組織特異基因的表達，最終導致植物開花時間延遲。在多年生的高山南芥中，TFL1阻止幼年植株感受低溫春化[8]；TFL1在柑橘中調控童期性狀[9]；促使將梨的PcTFL1-1和PcTFL1-2基因經(jīng)RNAi干擾后所獲得的轉基因植株開花提早[10]；將蘋果的TFL1基因干擾后，其童期明顯縮短[11]，說明TFL1基因在多年生植物中與維持童期性狀有關。

TFL1作為重要的開花抑制基因，在龍眼的研究中未見報道。近年來，福建農林大學園藝植物生物工程研究所實驗室對龍眼體胚發(fā)生過程開展相關的分子生物學研究，建立了龍眼胚性愈傷組織轉錄組數(shù)據(jù)庫[12]，對龍眼體胚發(fā)生過程中的miRNAs進行了鑒定[13]。該研究在這些基礎上，克隆了龍眼胚性愈傷組中TFL1的cDNA全長和gDNA序列，借助生物信息學方法初步推測DlTFL1的功能，預測調控DlTFL1的潛在miRNAs，并研究其在“四季蜜”龍眼不同組織部位中的表達模式，為進一步研究DlTFL1在龍眼成花表達調控和開花中的作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

龍眼松散型胚性愈傷組織（“紅核子”品種LC2細胞系），由賴鐘雄于1994年誘導并由福建農林大學園藝植物生物工程研究所長期進行繼代保存[14-16]。龍眼胚性愈傷組織的轉錄組由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供，SRR accession numbers：SRA050205?！八募久邸逼贩N龍眼不同組織部材料采自莆田農業(yè)科學研究所。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA提取與cDNA合成。松散形胚性愈傷組織總DNA的提取參考王鳳華等[17]的方法。參照林玉玲等[18]、賴呈純等[19]和李惠華等[20]的方法，提取龍眼胚性愈傷組織和“四季蜜”龍眼不同組織部位的總RNA，用于合成RT-PCR擴增和qPCR擴增的cDNA。

1.2.2 引物設計及PCR擴增

（1）轉錄組中已知序列擴增 將福建農林大學園藝植物生物工程研究所實驗室龍眼轉錄組數(shù)據(jù)庫中注釋為TFL1的Unigene序列，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析后，采用DNAMAN7.0分別設計其上下游引物，以龍眼松散型胚性愈傷組織cDNA為模板擴增TFL1的部分序列。

（2）3′-RACE 和 5′-RACE 引物設計 采用RACE法，根據(jù)轉錄組分析所得的序列分別設計2條3′-RACE 引 物 ， 結 合 GeneRacerTM3′Primer和GeneRacerTM3′Nested Primer引物，以龍眼松散型胚性愈傷組織cDNA為模板，進行巢式PCR反應擴增3′末端序列；根據(jù)轉錄組分析所獲得序列分別設計2條 5′-RACE 引物，并結合 GeneRacerTM5′Primer和GeneRacerTM5′Neste Primer引物，以龍眼松散型胚性愈傷組織cDNA為模板，進行巢式PCR反應擴增5′末端序列。

（3）拼接驗證與gDNA擴增 對轉錄組分析所得序列、3′末端序列和5′末端序列的測序結果進行全長拼接，設計拼接驗證引物，PCR反應驗證拼接結果。同時利用拼接驗證的引物，以龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，PCR擴增獲得其gDNA序列。所有的引物序列及擴增用途見表1。

PCR反應體系和擴增程序參照賴呈純等[19]的方法，根據(jù)擴增不同的目的片段，對PCR擴增程序進行相應的調整。獲得目的片段后切膠回收，TA克隆后進行PCR檢測，并送深圳華大基因公司測序。

1.2.3 生物信息學分析。使用DNAMAN7.0進行核苷酸序列的拼接以及氨基酸序列的多重比對；采用Gene Structure Display Server進行基因組序列分析;使用ExPASy Protparam在線軟件預測DlMFT和DlTFL1的理化性質；信號肽預測軟件為SignalP 4.0 Server；亞細胞定位預測采用 PSORTPrediction（plant）；EMBnet TMpred預測蛋白質跨膜結構；NetPhos2.0預測蛋白質磷酸化位點；PredictProtein預測蛋白質的其他功能位點；經(jīng)NCBI Blastp預測蛋白質的功能保守結構域，以PSIPRED預測蛋白質二級結構，Phyre2預測蛋白質三級結構；采用Mega6.06的Neighbor-Joining（鄰近相連法）構建核苷酸序列的分子系統(tǒng)進化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 潛在調控DlTFL1基因的miRNA預測。為了解miRNA與DlTFL1的相互調控關系，以林玉玲等[13]新鑒定的龍眼中保守或特異的miRNA序列為探針，以龍眼DlTFL1為靶基因預測的候選序列，采用psRNA Target在線軟件，預測可能參與調控DlTFL1基因表達的miRNA。

表1 基因克隆引物序列

1.2.5 DlTFL1在“四季蜜”龍眼不同組織部位中的表達分析。參照林玉玲等[18]建立的多基因內參體系，以檢測DlTFL1在“四季蜜”龍眼的根、葉、花蕾、花、小果、大果、果肉、果皮和種子中的表達情況。該試驗采用LightCycler480儀器和Takara SYBR ExScriptTM試劑，根據(jù)qPCR引物設計原則設計DlTFL1的上下游引物（表1），將龍眼的9個不同組織部位（根、成熟葉、花蕾、花、小果、大果、果肉、果皮和種子）的cDNA模板的混合樣進行5倍梯度系列稀釋制作標準曲線，通過軟件自動分析qPCR的擴增效率（E），E=10（-1/slope）。將 9個不同組織部位的cDNA稀釋15倍后作為模板進行qPCR擴增，qPCR反應體系和擴增程序參照林玉玲等[18]。每個反應設置3個重復，根據(jù)擴增曲線計算Ct值，獲得不同階段DlTFL1的mRNA相對含量，通過內參基因的校正最終得到DlTFL1的在“四季蜜”龍眼不同組織部位的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 龍眼胚性愈傷組織DlTFL1 cDNA全長序列及gDNA序列獲得與分析

將龍眼轉錄組數(shù)據(jù)[13]中注釋為TFL1的核苷酸序列（Unigene52977）及其推導的氨基酸序列分別在NCBI上經(jīng)Blastn和Blastp分析，與數(shù)據(jù)庫中TFL1的核苷酸和氨基酸序列具有較高的同源性，初步推斷該片段為龍眼胚性愈傷組織中DlTFL1的部分cDNA序列。

根據(jù)龍眼轉錄組序列，分別設計3′-RACE和5′-RACE引物，采用RACE法擴增DlTFL1的3′末端和5′末端序列，經(jīng)二輪PCR后均可擴增出與預期相符的片段。測序結果表明，DlTFL1的5′-RACE片段大小為308 bp，3′-RACE片段大小為458 bp。經(jīng)DNAMAN7.0拼接，DlTFL1的cDNA全長為866 bp；采用RT-PCR法對拼接結果進行驗證，測序結果表明DlTFL1的序列長為838 bp（圖1），與拼接結果相符合，GenBank登錄號為KJ200346。核苷酸序列分析結果表明，DlTFL1 cDNA全長866 bp，開放閱讀框為528 bp，編碼175個氨基酸，5′-UTR為69 bp，3′-UTR為269 bp，終止密碼子為TGA，PolyA尾巴為24 bp，具有典型的PolyA加尾信號“AATAAA”。將所獲得的全長序列及其推導的氨基酸序列經(jīng)Blastn和Blastp分析發(fā)現(xiàn)，與黑楊、毛果楊、小油桐、桃、葡萄、甜橙等的核苷酸與氨基酸序列的同源性較高，均在77%～83%，2個關鍵位點His88和Asp144均很保守。

采用與拼接驗證相同的引物擴增DlTFL1的gDNA序列，獲得與預期相符合的目的片段，經(jīng)測序驗證表明DlTFL1的gDNA序列長為1 492 bp（圖1），GenBank登錄號為KJ480957。序列分析結果表明，DlTFL1的gDNA序列的由4個外顯子和3個內含子組成（圖2）。

2.2 龍眼胚性愈傷組織DlTFL1生物信息學分析

圖1 DlTFL1的PCR擴增

圖2 DlTFL1的gDNA序列

利用ExPASy Protparam預測DlTFL1的理化性質，其分子式為C900H1394N244O255S6，分子量為19 904.8 kD，等電點7.89，含21個帶正電氨基酸和20個帶負電氨基酸，不穩(wěn)定系數(shù)為39.44，總親水性值為-0.271，因此DlTFL1為穩(wěn)定的親水蛋白。SignalP4.0 Server和EMBnet TMpred軟件預測DlTFL1沒有信號肽和跨膜結構。經(jīng)PSORT Prediction亞細胞定位預測可知DlTFL1定位在細胞質中。根據(jù)NetPhos 2.0預測，DlTFL1含有 12個蛋白磷酸化位點（Ser：5，Thr：4，Tyr：3）；經(jīng) PredictProtein 預測其他功能位點可知，DlTFL1有1個PEBP家族信號，1個cAMP與cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點、3個蛋白激酶C磷酸化位點、1個酪蛋白激酶II磷酸化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點、1個N-端?；稽c。Introprotein預測表明DlTFL1含有PEBP家族的保守結構域。

圖3 DlTFL1二級結構

采用PSIPRED在線軟件預測蛋白質的二級結構，DlTFL1主要由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成（圖3），其中α-螺旋9.1%、β-折疊32%、無規(guī)則卷曲58.9%。采用Phyre2在線軟件，以PEBP-like超家族的d1qoua（覆蓋率>90%，可信度100%）為模板建立DlTFL1的三級結構模型（圖4）。

圖4 DlTFL1三級結構

2.3 植物TFL 1氨基酸序列多重比對與進化樹分析

為研究植物TFL1家族的關系，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中麻風樹（Jatropha curcas）、毛果楊（Populus trichocarpa）、擬南芥 （Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、甜橙（Citrus sinensis）和葡萄（Vitis vinifera）等20種植物的TFL1氨基酸序列，利用Mega6.06軟件的鄰近相鄰法（NJ法）構建TFL1的系統(tǒng)進化樹（圖5），結果表明龍眼TFL1與麻風樹、葡萄、毛果楊和棉花等TFL1具有較近的親緣關系。

2.4 調控DlTFL1的m iRNA預測

psRNA Target預測結果（表2）表明，龍眼DlTFL1可能受到dlo-miR1114/2936/2948/4352/774這5種miRNA的調控，其中miR1114/2948/774以抑制靶標基因的翻譯方式調控DlTFL1的表達，而miR2936/4352以裂解mRNA的方式抑制靶標基因的表達。

2.5 DlTFL1的在“四季蜜”龍眼不同組織部位的表達分析

圖5 植物TFL1進化樹分析

qPCR結果表明，DlTFL1在“四季蜜”龍眼不同組織部位中mRNA的表達水平存在著明顯差異，其中在花蕾中的表達量最高，在根、葉和成花中的表達量較低，而在小果、大果、果肉、果皮和種子中甚至不表達（圖6）。說明在“四季蜜”龍眼的不同組織部位中，DlTFL1的轉錄水平呈現(xiàn)出了明顯的組織特異性和時空差異，在花蕾中的大量表達說明DlTFL1可能對“四季蜜”龍眼的花早期的器官發(fā)育有促進作用，在開花階段的表達量較低，對龍眼的開花可能具有抑制作用。

3 討論

3.1 DlTFL1是植物TFL1同源基因，可能具有抑制開花的功能

植物莖端和花序分生組織特性由2套互補的基因維持，花分生組織特異基因LEAFY、AP1等對花起啟動作用，而TFL1通過抑制LFY、AP1、CAL的表達延長營養(yǎng)生長，從而抑制成花轉變[21-22]。該研究從“紅核子”龍眼胚性愈傷組織中克隆了DlTFL1的cDNA全長序列和gDNA序列，DlTFL1的核苷酸及其推導的氨基酸序列與黑楊、毛果楊、小油桐、桃、葡萄、甜橙等的核苷酸與氨基酸同源性較高，2個關鍵位點His88和Asp144均很保守，具有保守的PEBP結構域；gDNA序列與其他植物相同，含有4個外顯子和3個內含子；DlTFL1可能還受到miRNA的調控。序列分析和系統(tǒng)進化樹分析證明DlTFL1是植物TFL1同源基因，可能具有類似的抑制植物開花的功能。

表 2 潛在調控DlTFL1的m iRNAs

圖6 DlTFL1在“四季蜜”龍眼不同組織部位的相對表達量

3.2 DlTFL1對龍眼花器官的發(fā)育可能具有促進作用

TFL1基因在營養(yǎng)生長和花序生長階段的頂端分生組織中表達，以維持莖端和花序分生組織的無限性，從而調控營養(yǎng)和生殖生長的進程[1，5]。TFL1蛋白是一種可移動的信號，均勻分布在分生組織中，但無法進入分生組織側面細胞從而保證原基細胞維持自己的特性[23]。李超瓊和羅莉等[24-25]的研究表明，小油桐 JcTFL1a、JcTFL1c（JcTFL3）主要在其童期和未開花植物的根部表達，其他組織中幾乎沒有表達；JcTFL1b主要在成年期植株的莖和幼果中表達，而過表達JcTFL1b（JcTFL2）擬南芥表現(xiàn)出晚花的性狀。該研究中DlTFL1在花蕾中的表達量最高，在根、成熟葉和成花中的表達量相對較低，而在其他組織部位中沒有表達。說明DlTFL1可能與“四季蜜”龍眼花早期的發(fā)育有關，同時還可能具有抑制龍眼開花的功能。關于DlTFL1的具體功能研究還有待進行亞細胞定位、基因功能驗證等，以進一步探討DlTFL1在龍眼花期調控與花發(fā)育等過程中的作用。

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