玫瑰花苞抗自由基能力的檢測

樊琛，胥慧貞，劉桂芹，曾慶華，李燕，孫小凡

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252059）

玫瑰花苞抗自由基能力的檢測

樊琛，胥慧貞，劉桂芹，曾慶華，李燕，孫小凡

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252059）

對玫瑰花苞抗多種自由基能力進行檢測。通過正交試驗分析溶劑濃度、料液比、處理時間以及提取溫度等對玫瑰花苞提取物清除自由基能力的影響。結(jié)果表明玫瑰花苞浸出液對DPPH·（2，2-二苯代苦味?；诫拢?、ABTS+·（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）的清除率可達90%以上，對超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率隨處理條件變化明顯，對羥基自由基（·OH）的清除率低于10%。對4種自由基的清除能力從大到小依次為：ABTS+·、DPPH·、O2-·、·OH。玫瑰花苞提取物對各種自由基具有清除能力。

玫瑰花苞；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基

玫瑰具有強肝養(yǎng)胃、活血調(diào)經(jīng)、潤腸通便、解郁安神、消炎殺菌、消除疲勞、改善體質(zhì)、潤澤肌膚的功效。近年來，對玫瑰花中生物活性物質(zhì)的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗突變、抗腫瘤、抑制高血壓和抑菌功能[1-3]。

本研究以玫瑰花苞為原料，運用正交試驗法，以料液比、提取時間、乙醇濃度、提取溫度為因素，提取玫瑰花苞中總抗氧化成分，為玫瑰花苞的綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花苞：北京同仁堂健康藥業(yè)（福州）有限公司，無腐爛、無蟲蛀。

乙醇、NaNO2、水楊酸、H2O2、FeSO4、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、HCl均為分析純；蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：sigma公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700紫外可見分光光度計：日本島津公司；SK1200H超聲清洗機：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；79-2雙向磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；SB-2000水浴鍋：上海愛朗儀器有限公司；TD5臺式多管架離心機：長沙英泰儀器有限公司。

1.3.1 樣品處理

稱取干玫瑰花苞樣本，用研缽研成粉末，懸于溶劑中，超聲處理浸提后抽濾，濾液于3 000 r/min離心15min后，置于冰箱中保藏，備用。

1.3.2 浸提液乙醇濃度篩選

料液比1∶200，超聲浸提15min，乙醇濃度分別為0%、25%、50%、無水乙醇。通過羥自由基和超氧自由基清除率篩選乙醇濃度。

1.3.3 正交試驗的設(shè)計

依據(jù)單因素預(yù)試驗的結(jié)果及文獻資料，選取四因素三水平條件，分別為：料液比、提取時間、溶劑（乙醇）濃度、提取溫度。其中，料液比（g/mL）為1∶100、1∶150、1∶200，提?。ǔ曁幚?5W）時間為15、30、45min，乙醇濃度為20%、35%、50%，提取溫度為20、40、60℃。按上述條件選取L9（34）正交表，如表1。

設(shè)f(x)為定義在m+1個節(jié)點a=x0＜x1＜…＜xm=b上的離散函數(shù)，即 f(x)完全由函數(shù)表(xj,f(xj)),j=0,1,···,m所確定。表1中xj為 4X1 DS18B20矩陣測量的溫度值，yj為精創(chuàng)儀器儀表廠生產(chǎn)的水銀溫度計測量的溫度，精度為0.01℃。

以提取物清除自由基（HO·、O2-·、ABTS+·、DPPH·）效率為考量指標，確定最佳料液比、處理時間、浸提溶劑的濃度、提取溫度等工藝條件。

表1 正交試驗設(shè)計表Table1 O r thogonal Test

1.3.4 體外抗自由基試驗

1.3.4.1 清除HO·能力的測定[4-6]

采用Fenton反應(yīng)體系法，2mL 1.96mmol/LH2O2，2mL 1.8mmol/LFeSO4和2mL 1.8mmol/L水楊酸-乙醇，0.1mL樣品溶液。其中，H2O2最后加入并啟動整個反應(yīng)。反應(yīng)體系37℃反應(yīng)30min，以蒸餾水為參比，在510 nm處測量溶液的吸光度值。以蒸餾水代替樣品溶液作空白對照。每個試樣作3個平行，取其平均值。根據(jù)下式計算HO·清除率：

式中：A0為空白對照組的吸光度；AX為加入樣品溶液后的吸光度；A1為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度值。

1.3.4.2 清除O2-·能力的測定[7-9]

采用鄰苯三酚自氧化法。取1mmol/L的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（pH8.2）4.5m L，置25℃水浴中預(yù)熱20min后，分別加入1mL試樣溶液和0.4mL 5mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入1.6mmol/LHCl1mL終止反應(yīng)，用紫外-可見分光光度計在波長325 nm處測定溶液的吸光度（AX）?？瞻讓φ战M以相同體積的蒸餾水代替樣品溶液，用紫外-可見分光光度計在波長325 nm處測定溶液的吸光度（A0），每個試樣作3個平行，取其平均值。數(shù)據(jù)代入下式計算清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1樣品空白的吸光度值。

1.3.4.3 清除ABTS+·能力的測定[10-12]

將2mL樣品溶液加入2mL稀釋后的ABTS溶液中，記錄7min時反應(yīng)溶液在734 nm處的A值，記為AX?？瞻讓φ战M為浸提溶劑與ABTS溶液混合。清除率公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1為樣品空白的吸光度值。

1.3.4.4 清除DPPH·能力的測定[12-13]

將DPPH以無水乙醇配制成0.2mmol/L的溶液，分別吸取2m L的樣品溶液和2m L的DPPH，避光混勻，反應(yīng)30min于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)X。空白對照組為浸提溶劑與DPPH溶液混合。清除率公式如下

式中：A0為空白對照組的吸光度值；AX為加入樣品溶液后的吸光度值；A1為樣品空白的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度篩選

料液比1∶200，超聲浸提15min，乙醇濃度分別為0%、25%、50%、無水乙醇。對超氧自由基和羥自由基清除率見表2。

表2 乙醇濃度的影響Table2 Effectsof SolventConcentration

如表2所示，浸出物對羥基自由基清除率低于超氧陰離子自由基清除率。在乙醇含量0%～25%時浸出液超氧自由基的清除率呈上升趨勢，而乙醇含量25%無水乙醇呈下降趨勢，因此正交試驗選擇乙醇濃度20%～50%。

2.2 正交試驗

以料液比、超聲提取時間、乙醇濃度、提取溫度為正交因素，正交試驗L9（34）結(jié)果見表3。

表3 HO·正交試驗結(jié)果Table 3 Resultsof HO·O rthogonal Test

續(xù)表3 HO·正交試驗結(jié)果Continue table3 Resultsof HO·Orthogonal Test

由表3，最佳水平分別為：料液比1∶100、浸提時間45min、乙醇濃度50%、浸提溫度60℃，最佳組合為A1B3C3D3，清除率為12.78%。各因素影響由大到小為：料液比、浸提時間、浸提溫度、乙醇濃度。

表4 O2-·正交試驗結(jié)果Table 4 Resultsof O2-·OrthogonalTest

由表4，料液比1∶100、浸提時間45min、乙醇濃度35%、浸提溫度60℃，超氧自由基的清除效果明顯，最佳組合為A1B3C2D3，驗證試驗結(jié)果顯示清除率為64.52%。各因素對清除率的影響從大到小依次為：料液比、乙醇濃度、浸提溫度、浸提時間。

如表5所示，各組玫瑰花苞提取物均對ABTS＋·有較強的清除作用。各因素的影響從大到小依次為：浸提時間、料液比、浸提溫度、乙醇濃度，最佳組合為A2B3C3D1，驗證試驗結(jié)果顯示清除率為100%。

由表6，影響浸出物對DPPH·清除率的各因素主次順序是：料液比、浸提時間、乙醇濃度、浸提溫度，最佳組合為A1B2C1D1，驗證試驗結(jié)果顯示清除率為93.49%。

表5 ABTS+·正交試驗結(jié)果Table5 Resultsof ABTS+·Orthogonal Test

表6 DPPH·正交試驗結(jié)果Table6 Resultsof DPPH·O rthogonal Test

3 結(jié)論

玫瑰花苞提取物對HO·、O2-·、DPPH·、ABTS＋4種自由基均有清除作用。其中，對DPPH·、ABTS＋2種自由基的清除能力強，清除率大于90%，對O2-·的清除能力次之，對HO·的清除能力弱。正交試驗結(jié)果顯示，料液比、浸提溫度、乙醇濃度、浸提時間4種因素中，料液比和浸提時間對試驗影響明顯而乙醇濃度、浸提溫度影響較小。4種自由基清除率的最佳組合條件不一致。

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Detection of Rosebud Anti-radical Ability

FANChen，XUHui-zhen，LIUGui-qin，ZENGQing-hua，LIYan，SUNXiao-fan
（Agricultural School，LiaoChengUniversity，Liaocheng 252059，Shandong，China）

This paper detects anti-radical ability of Rosebud.Effects of solvent concentration，solid-liquid ratio，extraction time and extraction temperature on extractive scavenging radicals were investigated by orthogonal test.The results showed thateach group of extractive had a scavenging capacity on 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·），2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）radical（ABTS+·）up to 90%，while the removalefficiencyof the superoxide anion radical（O2-·）floatswith differentconditions，the hydroxyl radical（·OH）removal rate is less than 10%.Rosebud extractiveshowed scavenging radicalsactivity.

Rosebud；1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical；2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.020

2013-11-08

聊城大學(xué)博士科研啟動基金（31805）

樊琛（1978—），女（漢），副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與衛(wèi)生學(xué)方向的研究。