微生物法快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量

張慧，吳環(huán)，黃偉乾，劉冬虹，冼燕萍，郭新東，葉梅，萬渝平

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；2.成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610000）

微生物法快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量

張慧1，吳環(huán)1，黃偉乾1，劉冬虹1，冼燕萍1，郭新東1，葉梅2，萬渝平2

（1.廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州510110；2.成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610000）

建立了一種高效快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。方法通過改進試驗用菌的保存和傳代，優(yōu)化樣液制備和加樣體積，結合八道排槍同時加樣操作和96孔酶標板技術進行檢測，減少了試驗步驟和試驗誤差。結果表明，方法標準曲線相關系數(shù)為0.9992，檢出限為2μg/100g，樣品平行試驗的相對標準偏差（RSD）在7.5%～9.5%之間，加標回收率在93.3%～105%之間，檢測周期縮短為2 d。與國標方法等相比較，本方法具有簡單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點，可準確快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量。

葉酸；微生物法；快速檢測

葉酸（Folic acid）屬于B族維生素，1941年被分離提純并定名為葉酸[1]。葉酸是一組化學結構相似，生化特征相近的化合物的統(tǒng)稱，由蝶啶、對氨基苯甲酸與1個或多個谷氨酸結合而成[2]。葉酸是維持人體生長發(fā)育及新陳代謝的重要水溶性維生素。有研究表明，人群中葉酸缺乏會導致胎兒先天性異常，特別是神經(jīng)管畸形的發(fā)生[3]；也會引起細胞性貧血和粒細胞減少，尤其對于處于生長發(fā)育旺盛期的嬰幼兒，如果缺少足夠的葉酸，生長就會受到嚴重影響[4]。嬰幼兒配方乳粉是以嬰幼兒生長時期的特殊營養(yǎng)需要而設計的產(chǎn)品，對于強化維生素的含量有嚴格要求；嬰幼兒配方乳粉中葉酸的含量十分微量，一般在20μg/100 g～200μg/100 g之間。因此，快速準確測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸的含量具有重要的意義。

目前測定葉酸的方法有比色法、薄層層析法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、微生物法和同位素放射免疫法[5-7]等。測定原料葉酸、純?nèi)~酸制品或藥品制劑中的葉酸質(zhì)量分數(shù)一般采用比色法；而生物體、食品中葉酸的測定多采用微生物法、同位素放射免疫法或色譜法、色-質(zhì)聯(lián)用法[8]。嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的測定可以采用微生物法和儀器法，但可能因奶粉基質(zhì)干擾的影響，儀器法的靈敏度和回收率都比微生物法低，微生物法的實際應用更為普遍。在第18版的AOAC標準方法中，食物中生物素、泛酸、葉酸、VB12和煙酸的第一分析方法均為微生物法；我國食品安全國家標準中關于嬰幼兒食品和乳品中葉酸含量的測定，微生物法是唯一的測定方法，其測定原理為：應用對葉酸具有極強特異性的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）菌種，一定條件下該菌種的生長繁殖速度與溶液中葉酸的含量成一定的對應關系來進行定量檢測[8-9]。本試驗在傳統(tǒng)的國家標準微生物法和商業(yè)化的試劑盒法的基礎上，通過改進試驗用菌的保存和傳代，優(yōu)化樣品溶液的制備，結合八道排槍同時加樣操作和96孔酶標板技術，簡化了試驗步驟、縮短了檢測周期、減少了殘留維生素帶來的污染，建立了快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗菌株：干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 7469（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，產(chǎn)地：美國）；培養(yǎng)基：乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，均為BD（碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，產(chǎn)地：美國）；標準品：葉酸（99.9%）（USP，上海安譜科學儀器有限公司，產(chǎn)地：美國）；抗壞血酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司），配制葉酸酪蛋白培養(yǎng)基時加入0.05%抗壞血酸鈉；1.2mLPP管（美國Corning公司）；1.2mL凍存管（美國Corning公司）。

試驗樣品：Standard ReferenceMaterial1849a（SRM 1849a）（National Institute of Standards and Technology，產(chǎn)地：美國，奶粉基質(zhì)的標準樣品，葉酸含量229.3± 6.2 ug/100 g）、市售嬰幼兒配方乳粉和市售孕婦奶粉。

儀器：TransferpetteRS-8八道排槍（德國BRAND）；HVE-50高壓滅菌鍋（日本平山公司）；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；通Z323K用型高速離心機（德國HERMLELabortechnik GmbH公司）；VORTEX 4 basic渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的制備與保存

將干酪乳桿菌干粉接種到已滅菌乳酸桿菌肉湯，（36±1）℃培養(yǎng)2 h～24 h。將乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物3 000 r/min離心10min，棄去肉湯培養(yǎng)基，加入無菌水如此清洗3次后得到不含有培養(yǎng)基的菌液，吸取一定體積的此菌液加入到已滅菌的含有甘油和抗壞血酸鈉的葉酸酪蛋白測定培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)麥氏單位約為2.0，加入凍存管中，制備成試驗用菌懸液，-80℃超低溫凍存。每次試驗時取出后即可使用。

1.2.2 標準工作液和標準曲線溶液的制備

葉酸標準工作溶液的濃度為0.60 ng/mL，在無菌條件下使用無菌濾器過濾備用。

在無菌條件下，按表1順序在滅菌小管中對葉酸標準工作液進行稀釋，制備相應濃度的標準曲線溶液。

表1 葉酸標準曲線溶液的制備Table 1 Thepreparation of folic acid standard curvesolution

在已滅菌的PP管中每管加入300μL系列標準曲線溶液和300μL含有0.05%濃度試驗用菌懸液的無菌葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，一式3份，使用渦旋振蕩器混合。

1.2.3 樣品測定液的制備

稱取5 g樣品，作20倍稀釋，95℃水浴30min，充分溶解后制得待測樣品溶液。將待測樣品溶液在無菌條件下使用無菌濾器過濾，根據(jù)樣品標示葉酸的含量進行適當稀釋，得到樣品工作液。

在無菌條件下，按表2順序在滅菌小管中對樣品工作液進行稀釋，制備相應濃度的樣品測定溶液。

表2 樣品測定液的制備Table 2 The preparation of sam p le determ ination solution

在已滅菌的PP管中每管加入300μL系列樣品測定溶液和300μL含有0.05%濃度試驗用菌懸液的無菌葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，一式3份，使用渦旋振蕩器混合。

1.2.4 培養(yǎng)

使用96孔試驗盒，將已滅菌的PP管插入試驗盒，每列8根管，使用八道排槍按1.2.2和1.2.3加樣后（36±1.0）℃培養(yǎng)24 h～28 h。

1.2.5 測定

混合均勻，使用酶標儀630 nm波長進行讀數(shù)。平行小管相對偏差小于15%的為有效數(shù)值。

1.2.6 樣品葉酸含量的計算

根據(jù)樣品每管的吸光值從葉酸標準曲線查得對應的葉酸含量，除以相對樣液體積v，得到每管樣品溶液中葉酸含量。由所有有效管中測得的數(shù)值計算平均值。樣品中葉酸含量按下列公式計算：X/（μg/100 g）=×100，式中：m為樣品質(zhì)量，（g）；f為樣品稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 菌種制備與保存方法的改進

傳統(tǒng)的微生物法常存在檢測周期長、操作繁瑣等問題。GB 5413.16-2010《食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中葉酸（葉酸鹽活性）的測定》是傳統(tǒng)的微生物法，實驗用菌株的保存與傳代，每月都要轉(zhuǎn)接一次作為月接種管，每次試驗前要從月接種管轉(zhuǎn)接一次作為日接種管，試驗時日接種管都要進行菌種的洗滌去除凍存培養(yǎng)基，然后制備成試驗用菌液，這樣每次試驗的耗時較長，步驟繁瑣，菌種制備需要2 d，試驗操作1 d，培養(yǎng)1 d～1.5 d，整個檢測周期耗時4 d～4.5 d。

本試驗方法中，試驗用菌懸液預先于-80℃超低溫凍存在含有甘油和抗壞血酸鈉凍存管中，其中甘油作為防凍劑防止冰晶對細胞造成傷害，有效保護了菌種[10]。每次試驗時只需要拿出一支添加到培養(yǎng)基中，不僅可以保證菌種被混勻到培養(yǎng)基中，也簡化了操作步驟；而凍存管中的抗壞血酸鈉在培養(yǎng)和檢測中也起到了一定的防止葉酸被氧化的作用。在整個試驗中，試驗操作1 d，培養(yǎng)1 d，僅需2 d就可以完成檢測，大大縮減了檢測周期，提高了工作效率。

2.2 樣液制備和測定方法的優(yōu)化

GB 5413.16-2010方法中，樣品溶液制備需要經(jīng)過多步稀釋，使用了大量需高溫滅菌的玻璃器皿，最終培養(yǎng)的試驗體積需要10mL，總體積較大，造成試驗操作耗時，而且操作過程中容易存在微量維生素污染的問題，導致實驗重復性差。本試驗方法中，標準曲線和樣品測定液的制備均使用一次性滅菌的1.2mLPP管，在保證檢測靈敏度的前提下，最終培養(yǎng)的試驗體積只需要600μL（樣品測定溶液和培養(yǎng)基各為300μL），由于添加體積的縮小，可以使用八道排槍進行操作，不僅操作簡便，而且保證了每個PP管中的添加量一致，提高了試驗的準確度；同時，一次性滅菌PP管的使用，避免了殘留維生素的污染。

德國拜發(fā)公司推出VitaFastR維生素檢測試劑盒，試驗原理與國標相同，它將96孔酶標板和酶標儀引入到試驗中，以ELISA微孔板方法為形式和載體，進行維生素的測定，這種商業(yè)化的試劑盒法操作簡便，大大縮短檢測時間[11-12]，但其配套標準溶液的保藏是影響試驗結果準確性的關鍵因素，如果樣品溶液只做一個稀釋度的檢測，會極大地影響檢驗結果準確性，而且價格昂貴。本試驗方法中，在改進菌種制備和保存、樣品溶液制備方法的基礎上，引入96孔酶標板技術，進一步縮短檢測時間，提高工作效率，而且降低了試驗成本。

2.3 標準曲線與方法的檢出限

以表1的系列葉酸濃度做為橫坐標，以吸光度值做為縱坐標，根據(jù)四參數(shù)方程擬合標準曲線，結果如圖1所示。

圖1 葉酸標準曲線Fig.1 Folic acid standard curve

標準曲線相關系數(shù)達到0.999 2，表明相關性良好。根據(jù)樣品的處理和回收率情況，計算本方法的檢出限為2μg/100 g，表明方法靈敏度高。

2.4 方法回收率和重復性試驗

2.4.1 加標回收試驗

配制葉酸標準溶液濃度為10 000 ng/mL，以SRM 1849a為試驗樣品，分別稱取4次5 g試驗樣品，各加入0、0.5、1.0、2.0m L葉酸標準溶液，即加標量分別為0、5 000、10 000、20 000 ng，然后分別定容至100mL，按步驟1.2進行試驗，分別做3次重復試驗，試驗結果如表3所示，回收率為93.3%～105.0%，表明方法回收率高。

表3 加標回收試驗結果Tab le3 Theadd ition standard recovery test's result

2.4.2 重復性試驗

分別對SRM 1849a和6種不同的配方奶粉進行檢測，每種樣品做6次平行對照。結果顯示，SRM 1849a的RSD值為7.4%，6種奶粉6次平行試驗的RSD在7.5%～9.5%之間（表4），說明本方法的重現(xiàn)性良好。

表4 重復性實驗結果Table4 Repetitive test’s result

2.5 方法的比較

根據(jù)2.1和2.2所述，相比GB 5413.16-2010，本方法具有檢測效率高、準確靈敏等特點；相比商業(yè)化試劑盒方法，本方法具有檢測成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。

試驗進一步比較了采用反相離子對色譜法和本方法進行檢測的結果，見表5。

表5 反相離子對色譜法與本方法的比較Table 5 The com parison of reversed phase ion pair chromatography andm icrobiologicalm ethod

其中反相離子對色譜法的前處理條件參照GB 5413.16-2010（稱取樣品10g，加磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，臨用前按1.0 g/100m L加入抗壞血酸，再用氫氧化鈉調(diào)到pH7.0）70mL溶解，置于121℃滅菌15min，冷卻后滴加幾滴（1+1）鹽酸溶液使蛋白沉淀，再定容至100mL，過濾后，濾液待測），色譜條件參照GB/T17813-1999《復合預混料中煙酸、葉酸的測定高效液相色譜法》，方法檢出限為60μg/kg（即6μg/100 g）。反相離子對色譜法的樣品加標量為16.46μg，本方法的樣品加標量為5 000 ng。由表5可見，反相離子對色譜法的回收率在80%左右，實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出樣品中葉酸含量不同，其回收率差異較大，葉酸含量越大，回收率越高；而本方法的回收率在98%左右，不同葉酸含量樣品的回收率相差不大，回收穩(wěn)定性較好。

3 結論

本試驗在傳統(tǒng)的國家標準微生物法和商業(yè)化的試劑盒法的基礎上，通過對整個實驗過程的優(yōu)化，將試驗用菌懸液預先超低溫凍存在含有甘油的凍存管中，同時采用八道排槍進行加樣，減少了試驗步驟和試驗誤差；將96孔酶標板試驗原理引用到微生物法中，采用酶標儀微孔板方式對維生素進行讀數(shù)[13]，建立了快速檢測嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的微生物法。與國標等其它方法相比較，本方法具有檢測周期短、操作步驟簡便、結果準確、重現(xiàn)性高和節(jié)約檢測成本等優(yōu)勢，適合在常規(guī)試驗室進行推廣應用。

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Rapid M icrobiologicalM ethods Detecting the Content of Folic Acid in Infant Formula M ilk Powder

ZHANGHui1，WUHuan1，HUANGWei-qian1，LIUDong-hong1，XIANYan-ping1，GUOXin-dong1，YEMei2，WANYu-ping2
（1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，Guangzhou 510110，Guangdong，China；2.Chengdu Food and Drug Inspection Institute，Chengdu 610000，Sichuan，China）

A simpleand rapidmethod wasestablished based onmicrobiologicalmethods to determine folic acid in infant formula milk powder.The experimental procedures and test errors were reduced through improved preservation and passage of bacteria，optimization of sample preparation and sample volume with the eight volley and 96-wellmicroplate.Under the optimal conditions，the correlation coefficient of standard curvewas 0.9992，detection limitwas2μg/100 g，the relative standard deviation （RSD）of sample parallel assaywere between 7.5%-9.5%，Themean recoveries for infant formulamilk powderwere between 93.3%-105%，and test cycle was reduced to 2 days.Themethods compared with national standard method were simple，rapid，sensitive and reproducible characteristics so that the content of folic acid in infant formulamilk powder was accurately and rapidly tested.

Folic acid；microbiologicalmethod；Rapid test

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.017

2015-03-02

廣東省質(zhì)量技術監(jiān)督局科技項目（2013CS01）

張慧（1985—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品微生物檢驗。