姜黃素衍生物L(fēng)6H4對糖脂代謝異常大鼠的治療作用及其機(jī)制

陳四梅，張森凱，劉網(wǎng)網(wǎng)，徐夢菲，陳三妹，陳國榮，陳筱菲

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015；2.樂清市人民醫(yī)院，浙江 溫州325605；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；4.紹興文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江紹興 312000）

·論 著·

姜黃素衍生物L(fēng)6H4對糖脂代謝異常大鼠的治療作用及其機(jī)制

陳四梅1，張森凱2，劉網(wǎng)網(wǎng)3，徐夢菲3，陳三妹4，陳國榮3，陳筱菲1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015；2.樂清市人民醫(yī)院，浙江 溫州325605；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325015；4.紹興文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江紹興 312000）

目的：觀察姜黃素衍生物L(fēng)6H4對糖脂代謝異常大鼠代謝指標(biāo)的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法：24只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常空白對照組（NC組，n=8），高脂組（HF組，n=8）和高脂治療組（FT組，n=8），后2組高糖高脂飼料喂養(yǎng)12周。第5周時開始給予藥物治療8周，12周末檢測各組大鼠血清生化指標(biāo)、肝臟和骨骼肌的甘油三酯（TG），以及與糖脂代謝相關(guān)的多項(xiàng)指標(biāo)，并觀察光鏡下肝臟與骨骼肌的病理學(xué)變化。結(jié)果：①HF組與NC組比較，體質(zhì)量增加（P＜0.05），肝濕質(zhì)量、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（HOME-IR）、血清TG、肝臟TG、骨骼肌TG、血清ALT、血清游離脂肪酸（FFA）、高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和白介素6（IL-6）水平均升高（均P＜0.01），脂聯(lián)素（ADP）、瘦素（LEP）下降（分別P＜0.01，P＜0.05），成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF-21）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；②FT組與HF組比較，F(xiàn)INS、肝濕質(zhì)量與肝指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），體質(zhì)量、肝臟TG、血TG、ALT、FBG、HOMEIR、FFA、hs-CRP水平降低（P＜0.01），骨骼肌TG、IL-6水平下降（P＜0.05），F(xiàn)GF-21、ADP升高（P＜0.01）；③HF組肝臟可見明顯脂肪變及炎癥細(xì)胞浸潤，骨骼肌細(xì)胞間質(zhì)可見脂肪浸潤，治療后肝臟脂肪變以及骨骼肌脂肪浸潤明顯改善。結(jié)論：姜黃素衍生物L(fēng)6H4對高脂高糖喂養(yǎng)大鼠具有控制體質(zhì)量、保護(hù)肝功能、改善胰島素抵抗的作用，可能與其調(diào)脂、抑制炎癥、降低異位脂肪存積相關(guān)。

姜黃素衍生物L(fēng)6H4；胰島素抵抗；異位脂肪沉積；高脂血癥；大鼠

肥胖已成為全球公共健康問題，是脂質(zhì)代謝紊亂、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、2型糖尿病等疾病的高危因素。2012年我國成年人血脂的調(diào)查報(bào)告[1]顯示，31.5%的成年人有高總膽固醇血癥。研究[2]表明，單純性肥胖兒童多存在血脂代謝紊亂情況。因此伴隨肥胖而來的相關(guān)代謝性疾病將使社會及醫(yī)療體系面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)。近些年較多學(xué)者致力于肥胖及其相關(guān)代謝性疾病關(guān)系研究，不斷摸索開發(fā)新的降脂降糖藥物，并探討藥物的治療機(jī)制。其中，姜黃素及相關(guān)衍生物的抑制炎癥、調(diào)脂降糖的作用已被公認(rèn)[3]，但天然的姜黃素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在生物體內(nèi)的利用度低。為克服這一弱點(diǎn)，研究者們開始研究通過改變姜黃素的結(jié)構(gòu)改善其生物利用度。本研究所用姜黃素衍生物L(fēng)6H4系溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院在姜黃素的基礎(chǔ)上合成的新型不對稱單羰基姜黃素衍生物，前期實(shí)驗(yàn)[4]已證明較姜黃素具有更好的穩(wěn)定性，同時細(xì)胞水平研究表明該新型姜黃素衍生物具有良好的炎癥抑制活性。我們利用高脂高糖飼料飼養(yǎng)SD大鼠，探討姜黃素衍生物L(fēng)6H4對高脂高糖大鼠相關(guān)代謝指標(biāo)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物喂養(yǎng)方法及處理 SD大鼠購自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，24只，雄性，SPF級，體質(zhì)量150～180 g。隨機(jī)分為3組，每組8只：正常空白對照組（NC組）、高脂對照組（HF組）和高脂治療組（FT組）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，NC組始終常規(guī)飼料喂養(yǎng)，HF組和FT組給予高脂高糖飼料（飼料組成[5]：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規(guī)飼料）飼養(yǎng)12周，第5周開始進(jìn)行為期8周的藥物治療，給藥劑量每天20 mg/kg。藥物為白色粉末，不溶于水，操作時溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液灌胃給予，NC組給予等劑量安慰劑（1%的羥甲基纖維素鈉溶液）治療。受試藥物姜黃素衍生物L(fēng)6H4由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院梁廣教授惠贈。

1.2 主要試劑 ELISA試劑盒購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司，胰島素放射免疫試劑盒購于上海瑞齊生物科技有限公司。

1.3 血清標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 治療滿8周后，大鼠空腹12 h，10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，準(zhǔn)確稱取大鼠質(zhì)量，切斷股動脈采血8～10 mL于促凝離心管中，室溫靜置低溫離心取得血清分裝在數(shù)個1.5 mL EP管中，藏于-40 ℃冰箱備用。全自動生化分析儀檢測相關(guān)生化指標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測血清高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、游離脂肪酸（FFA）、鼠成纖維細(xì)胞生長因子21（FGF-21）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、瘦素（LEP）、脂聯(lián)素（ADP），放射免疫法檢測血清空腹胰島素水平（FINS），實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.4 肝臟、肌肉組織甘油三酯（TG）的測定 準(zhǔn)確稱取100 mg大鼠骨骼肌組織與肝臟組織，加入甲醇/氯仿混合液（甲醇∶氯仿，體積比=2∶1），超聲波破碎，4 ℃靜置抽提30 min，6 000 r/min低溫離心10 min，取有機(jī)脂質(zhì)抽提相溶于異丙醇中，由全自動生化分析儀測定結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，詳細(xì)操作完全參照Folch法[6]。

1.5 病理學(xué)檢測 觀察各組大鼠肝臟的大小形態(tài)、顏色、質(zhì)地，并將取出的肝臟、骨骼肌組織塊（約10 mm×10 mm×2 mm）用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，中性樹膠封固。光鏡下觀察組織的脂肪變、炎癥等情況。

1.6 胰島素抵抗的評價 采用穩(wěn)態(tài)模型計(jì)算的胰島素抵抗指數(shù)[7]（homeostasismodel assessment of insulin resistance index，HOMA-IR）評價胰島素抵抗，計(jì)算公式：HOMA-IR=空腹血糖（FBG）（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，與NC組比較，HF組大鼠體質(zhì)量、肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)（肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量）均升高（P＜0.01）；與HF組比較，F(xiàn)T組大鼠體質(zhì)量下降（P＜0.01），肝濕質(zhì)量與肝指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。圖1示各組大鼠實(shí)驗(yàn)過程中體質(zhì)量的變化趨勢。

表1 各組大鼠一般指標(biāo)比較（n=8，±s）

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化趨勢圖

2.2 病理變化

2.2.1 肉眼觀察：NC組大鼠肝臟外觀形態(tài)正常，呈紅褐色，表面光滑有光澤，邊緣銳利，質(zhì)韌；HF組大鼠肝臟體積明顯增大，表面粗糙，包膜緊張，邊緣變鈍，顏色為紅黃相間，質(zhì)軟，局部肝葉呈明顯脂肪變性。FT組肝體積近似正常組，呈現(xiàn)磚紅色，表面光滑，邊緣銳利。NC組骨骼肌表面光滑，呈肌紅色，柔軟質(zhì)韌彈性良好，HF組骨骼肌觸之有油膩感，顏色偏暗，彈性尚可，治療后油膩感減輕。

2.2.2 光鏡觀察：HE染色NC組肝臟肝細(xì)胞排列正常，無脂滴和炎癥細(xì)胞浸潤，骨骼肌纖維呈細(xì)長條帶狀，互相平行排列，細(xì)胞核緊貼肌膜分布，肌纖維中橫紋清晰可見。HF組肝細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性脂肪變性，以中央靜脈周圍最為明顯，細(xì)胞體積增大，胞漿中有大量脂滴空泡，核居邊，且小葉內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤。骨骼肌細(xì)胞內(nèi)見少許脂肪空泡，間質(zhì)脂肪空泡明顯。FT組肝脂肪變明顯改善，骨骼肌細(xì)胞未見脂肪空泡，與NC組無肉眼可見異常。見圖2。

2.3 血清指標(biāo) HF組與NC組比較，F(xiàn)BG、FINS顯著升高（P＜0.01），HOME-IR明顯升高；FT組與HF組比較，F(xiàn)BG顯著降低（P＜0.01），F(xiàn)INS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HOME-IR降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

圖2 各組大鼠肝臟與骨骼肌石蠟切片（HE，×400）

表2 各組大鼠間FBG、FINS、HOME-IR的比較（n=8，±s）

2.4 血清、肝臟與肌肉組織TG含量 HF組與NC組相比較，血清、肝組織與肌組織的TG含量顯著增高（P＜0.01），ALT顯著升高（P＜0.01）；與HF比較，F(xiàn)T組各組織TG含量得到顯著改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ALT顯著下降（P＜0.01）。見表3。

2.5 相關(guān)炎癥因子 HF組與NC組比較，F(xiàn)FA、hs-CRP、IL-6顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），ADP、LEP顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。FGF-21在HF組有下降的趨勢，差異不明顯，在FT組明顯升高，與HF組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4-5。

表3 各組大鼠血TG、肝TG與骨骼肌TG的結(jié)果比較（n=8，）

表3 各組大鼠血TG、肝TG與骨骼肌TG的結(jié)果比較（n=8，）

與NC組比：aP＜0.01；與HF組比：bP＜0.05，cP＜0.01

表4 各組大鼠FFA、hs-CRP、FGF-21結(jié)果比較（n=8，）

表4 各組大鼠FFA、hs-CRP、FGF-21結(jié)果比較（n=8，）

與NC組比：aP＜0.01；與HF組比：bP＜0.01

表5 各組大鼠ADP、LEP、IL-6的比較（n=8，）

表5 各組大鼠ADP、LEP、IL-6的比較（n=8，）

與NC組比：aP＜0.01；與HF組比：bP＜0.05，cP＜0.01

3 討論

近年來關(guān)于肥胖患者糖脂代謝紊亂的研究頗多，普遍認(rèn)為胰島素抵抗、慢性炎癥以及異位脂肪存積等是肥胖與相關(guān)代謝性疾病關(guān)聯(lián)的主要因素，而脂肪組織分泌的各類細(xì)胞因子則是它們相互關(guān)聯(lián)的紐帶[8]。正常情況下過多的脂肪，作為能量儲存庫，存在于脂肪組織。過度肥胖時，脂肪細(xì)胞會產(chǎn)生胰島素抵抗來對抗脂肪組織的擴(kuò)張，因而限制了脂肪組織進(jìn)一步的脂肪合成以及脂肪細(xì)胞分化，同時促進(jìn)脂肪細(xì)胞分解，使得FFA增加，導(dǎo)致異位脂肪組織攝取FFA增加，出現(xiàn)脂肪異位存積。

從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)到臨床人群觀察研究的諸多研究結(jié)果表明，冠心病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等很大程度上是一種系統(tǒng)性的炎癥過程[9]。炎癥使機(jī)體處于分解代謝狀態(tài)，它通過胰島素抵抗機(jī)制，抑制原本胰島素敏感區(qū)域的合成代謝，如脂肪組織與骨骼肌，從而優(yōu)先保證炎癥區(qū)域的營養(yǎng)供給，其本質(zhì)是導(dǎo)致胰島素作用組織產(chǎn)生胰島素抵抗[9]。本實(shí)驗(yàn)通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠共12周，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HF組表現(xiàn)為明顯體質(zhì)量增加、炎癥、糖脂代謝紊亂以及脂肪異位沉積等胰島素抵抗表現(xiàn)，與相關(guān)研究[10]結(jié)果一致。經(jīng)過藥物治療的FT組，炎癥得到明顯控制，血清FFA下降，肝臟和骨骼肌TG明顯下降，提示姜黃素衍生物L(fēng)6H4可作用于脂肪組織，抑制促炎因子同時促進(jìn)抑制炎癥脂肪細(xì)胞因子如ADP等分泌來降低高血脂和脂肪異位存積，改善肝功能，降低胰島素抵抗。

近幾年有關(guān)FGF-21降糖作用的研究頗多，研究[11]表明FGF-21是一種不依賴胰島素而是通過誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子1來增加組織對葡萄糖攝取的成纖維細(xì)胞生長因子。同時FGF-21提升胰島素的敏感性，維持葡萄糖脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)β細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HF組比較，F(xiàn)T組的血清FGF-21顯著上升，而FINS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)BG卻顯著下降，提示姜黃素類似物L(fēng)6H4可能通過提高大鼠體內(nèi)FGF-21合成表達(dá)調(diào)節(jié)血糖。

綜上所述，姜黃素類似物L(fēng)6H4有效地增加了促脂肪酸氧化的因子，減少了抑脂肪酸氧化的因素，從而改善了異位脂肪存積，減輕炎癥反應(yīng)，降低循環(huán)FFA濃度，所有的這些效應(yīng)共同提高了胰島素的敏感性，從而使得血糖血脂紊亂得到糾正，避免了胰島素抵抗進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的代謝性疾病，具有良好的抑制炎癥、降糖、調(diào)脂作用，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

The therapeutic effect of curcumin derivatives L6H4 on rats with abnormalities of glucose and lipid me-tabolism and its mechanism

CHEN Simei1, ZHANG Senkai2, LIU Wangwang3, XU Mengfei3, CHEN Sanmei4,CHEN Guorong3, CHEN Xiaofei1.
1.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Yueqing People’s Hospital, Wenzhou, 325605; 3.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 4.School of Medical Sciences, Shaoxing University, Shaoxing, 312000

Objective: To observe the effect of curcumin derivatives L6H4 on rats with abnormalities of glucose and lipid metabolism, and preliminarily study the mechanism of it. Methods: Twenty-four male SD rats were randomly allocated into three groups: normal control group (NC group, n=8), high fatty group (HF group, n=8), and fatty treatment group (FT group, n=8). To fed the rats in HF group and FT group with high fat and surgar diet for 12 weeks, from the 5th week with drug treatment for 8 weeks, at the end of 12th week, the following indexes were measured respectively in each group: serum biochemical indexes, liver and skeletal muscle triglycerides, and related indicators of sugar and lipid matabolism. Observing the liver pathological changes at the same time. Results: ①Compared HF group with NC group: weight gain (P＜0.05), liver weight, fasting blood glucose (FBG), fasting insulin (FINS), insulin resistance index (HOME-IR), serum triglycerides, liver triglyceride, skeletal muscle triglycerides, serum ALT, FFA, high-sensitivity c-reactive protein (hs-CRP) and interleukin 6 increased (P＜0.01), adiponectin and leptin decreased (P＜0.01, P＜0.05, respectively). ②Compared the FT group with HF group: weight and ALT loss (P＜0.01), liver weight and liver index had no obvious difference, FBG decreased (P＜0.01), FINS (P＞0.05), the HOME-IR decreased (P＜0.01), serum triglycerides, liver triglycerides andskeletal muscle triglyceride were reduced (P＜0.01, P＜0.01, and P＜0.05, respectively), FFA and hs-CRP reduced (P＜0.01), fibroblast growth factor 21 (FGF-21) increased (P＜0.01), adiponectin, interleukin 6 increased with P＜0.01 and P＜0.05, respectively. ③Infammatory injury in hepatic tissue of HF groups was slight, while fatty degeneration in hepatic tissue and skeletal muscle were obvious, the condition was signifcantly reduced in the FT group. Conclusion: Curcumin derivatives L6H4 has the effect of controlling weight, protecting the liver function and improving the condition of insulin resistance on high fat and sugar-fed rats.

curcumin derivatives L6H4; insulin resistance; ectopic fat deposition; hyperlipidemia; rats

R58

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.005

2014-08-31

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011c23123）；溫州市高層次人才創(chuàng)新技術(shù)項(xiàng)目。

陳四梅（1988-），女，江西永修人，碩士生。

陳筱菲，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wzchenxiaofei@163.com。