IL-10、IFN-γ對(duì)兒童噬血細(xì)胞綜合征的檢測(cè)意義

徐智勝，鄭雙利，李原，曾煒煒，陳敏，錢江潮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027）

·臨 床 經(jīng) 驗(yàn)·

IL-10、IFN-γ對(duì)兒童噬血細(xì)胞綜合征的檢測(cè)意義

徐智勝，鄭雙利，李原，曾煒煒，陳敏，錢江潮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027）

目的：評(píng)價(jià)血清IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ對(duì)兒童噬血細(xì)胞綜合征（HPS）的早期診斷及預(yù)后的價(jià)值。方法：采用前瞻性研究方法，對(duì)20例診斷為HPS患兒分成治療前和治療后，以20例正常體檢兒童作為陰性正常對(duì)照組，再選取緩解期急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）18例和膿毒癥患兒22例血清作為陽性對(duì)照組。通過流式細(xì)胞儀流式微球術(shù)對(duì)血清IL-6、IL-10、IL-18、IFN-γ水平進(jìn)行測(cè)定。比較患兒治療前后和不同分組之間血清4種細(xì)胞因子水平。結(jié)果：4種細(xì)胞因子水平隨患兒HPS治療前后明顯變化，治療前4種細(xì)胞因子水平明顯高于治療后和正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPS患兒IL-10、IFN-γ水平較正常對(duì)照組、ALL患兒組及膿毒癥患兒組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：HPS患兒IL-10和IFN-γ水平相比ALL和膿毒癥患兒顯著升高，可以作為兒童HPS早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的臨床指標(biāo)。

兒童；噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥；噬血細(xì)胞綜合征；細(xì)胞因子；診斷價(jià)值

噬血細(xì)胞綜合征（hemophagocytic syndrome，HPS）又稱噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）是一種單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-組織細(xì)胞系統(tǒng)增生性疾病。目前HPS已成為嚴(yán)重威脅兒童生存的一種非腫瘤性疾病，以往患兒5年的生存率只有22%，通過采用國際組織細(xì)胞病協(xié)會(huì)推行免疫化療等治療手段已使該病的3年生存率上升至60%[1]。為了進(jìn)一步提高生存率，有必要對(duì)HPS進(jìn)行深入的研究，特別是HPS的早期準(zhǔn)確的診斷，以便進(jìn)行有效的治療，而細(xì)胞因子對(duì)于HPS的早期診斷有一定的價(jià)值，有文獻(xiàn)[2]報(bào)道HPS輕重的關(guān)鍵點(diǎn)是細(xì)胞因子釋放量的多少，所以探討細(xì)胞因子在HPS的診斷時(shí)、治療后的變化，以期望為HPS的早期診斷、隨訪提供一定的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集自2011年9月1日至2013年3月31日間我科收治診斷為HPS的患兒20例，其中男12例，女8例，年齡2個(gè)月～13歲半，中位年齡4歲，死亡1例，復(fù)發(fā)2例。全部病例均符合2004年國際組織細(xì)胞協(xié)會(huì)HPS研究小組公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，符合以下8項(xiàng)中的5項(xiàng)：①發(fā)熱；②脾大；③血細(xì)胞減少（外周血常規(guī)累及兩系或三系）：血紅蛋白（Hb）＜90 g/L（新生兒Hb＜100 g/L），血小板＜100×109/L，中性粒細(xì)胞＜1.0×109/L；④高甘油三酯血癥和/或低纖維蛋白原血癥：甘油三酯≥2.0 mmo/L或≥正常均值的3倍SD，纖維蛋白原≤1.5 g/L或≤3倍SD；⑤NK細(xì)胞活性降低或缺如；⑥血清鐵蛋白≥500 mg/L；⑦可溶性CD25（即可溶性IL-2受體）升高（≥2 400 U/mL）；⑧骨髓/脾臟/淋巴結(jié)中噬血細(xì)胞現(xiàn)象，無惡性腫瘤的證據(jù)。正常體檢兒童20例作為正常對(duì)照組，由于HPS常伴感染，且與腫瘤有一定的相關(guān)性，再收集急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）患兒18例、膿毒癥患兒22例的血清作為HPS患兒的對(duì)照組。對(duì)照組與正常組之間年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2 標(biāo)本采集和檢測(cè)方法 ①采集患兒治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后、正常對(duì)照、確診ALL及膿毒癥治療前，無菌采集外周靜脈血2 mL。室溫靜置待血完全凝固，前提是不含任何抗凝劑等會(huì)影響結(jié)果的添加劑，然后取血清利用流式細(xì)胞儀流式微球術(shù)（cytometric bead assay，CBA）進(jìn)行檢測(cè)，所有嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。②穿孔素1（perforin 1，PRF1）基因突變的檢測(cè)：從外周血用專門的試劑盒提取DNA，然后采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的方式擴(kuò)增PRF1基因的外顯子和內(nèi)含子區(qū)的片段進(jìn)行篩查。外顯子主要用premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5對(duì)引物，由生物公司合成PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，采用ABI3730 DNA測(cè)序儀進(jìn)行直接測(cè)序，經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）Genebank BLAST軟件比對(duì)突變的位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以M（QR）或表示。治療前后細(xì)胞因子水平比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)加秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon），HPS患兒組與正常對(duì)照組、ALL患兒組和膿毒癥患兒組比較采用t檢驗(yàn)加秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPS患兒臨床特征 所有HPS患兒均符合2004年國際組織細(xì)胞協(xié)會(huì)HPS研究小組公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

2.2 HPS患兒治療前后細(xì)胞因子水平 治療前IL-6、IL-10、L-18及IFN-γ均顯著高于治療后水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

HPS患兒IL-10較正常對(duì)照、ALL及膿毒癥患兒顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IFN-γ顯著高于正常對(duì)照組、ALL患兒組及膿毒癥患兒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPS患兒組的IL-18水平較正常對(duì)照組亦有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與HPS患兒組比，ALL患兒組IL-18有更加明顯的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.3 PRF1基因突變篩查 所有HPS患兒均進(jìn)行了PRF1基因突變篩查，未發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變。

3 討論

兒童HPS是多種致病因素引起的淋巴細(xì)胞及組織細(xì)胞過度增殖、活化，從而產(chǎn)生大量炎性因子，引起的一種可危及生命的過度炎性反應(yīng)[4]。細(xì)胞因子在HPS的發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。HPS發(fā)病主要是由于巨噬細(xì)胞被活化的T淋巴細(xì)胞刺激后分泌超量的細(xì)胞因子，使T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞均處于失控的活化狀態(tài)所致[5]。在一定的情況下可以將HPS視為細(xì)胞因子?。╟ytokine disease）或者巨噬細(xì)胞激活綜合征。

細(xì)胞因子IL-10是一種趨化因子（CXC），是細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化因子及B細(xì)胞活化因子，1985年Luster等在研究IFN-γ誘發(fā)的免疫應(yīng)答時(shí)從U937細(xì)胞中克隆到IL-10，能夠在干擾素的刺激下能分泌，是由Th2輔助細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，此外活化的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、某些非淋巴細(xì)胞如上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞也可以產(chǎn)生IL-10[6]。IL-10的受體CXCR3是一種G蛋白偶聯(lián)的七亞單位穿膜受體，也是IL-10的一種選擇性受體，可以誘導(dǎo)活化的效應(yīng)細(xì)胞向特定炎癥部位遷移。IL-10能趨化招募活化的T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等向特定炎性細(xì)胞遷移[7]。IL-10與其受體CXCR3的相互作用，對(duì)NK細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞起重要的調(diào)節(jié)作用[6]。IL-10在細(xì)胞免疫中起到重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用，主要通過下面幾種方式：①抑制巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞分泌致炎因子如IL-1、IL-6、TNF-α和趨化因子；②抑制抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面主要組織相容性復(fù)合物-I I類分子及某些輔助分子如B7的表達(dá)，降低APC遞呈抗原的能力；③通過直接或者間接抑制巨噬細(xì)胞的輔佐作用，進(jìn)而抑制NK細(xì)胞、Th1的增殖活化；④抑制Th0細(xì)胞向Th1方向分化，抑制炎癥細(xì)胞向炎癥部位趨化。IL-10缺乏在多種自身免疫性疾病發(fā)病過程中起促進(jìn)作用，如自身免疫性甲狀腺炎、炎癥性腸病[8]。

表1 20例HPS患兒臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查

表2 HPS患兒治療前后細(xì)胞因子水平比較[n=20，M（QR）或± s，pg/mL]

本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患兒組及ALL患兒組IL-10的水平高于正常對(duì)照組，但HPS患兒組升高得更加明顯。而HPS患兒組中，由于其IFN-γ的明顯增高，刺激了IL-10的大量分泌進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。升高的IL-10與其受體CXCR3的互相作用，既可以通過吸引細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞從而清除如IFN-γ等之類的因子，又抑制巨噬細(xì)胞的輔佐作用導(dǎo)致異常的致病性T細(xì)胞反應(yīng)，使減少組織吞噬巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致噬血細(xì)胞的增多，從而使血細(xì)胞進(jìn)行性下降。因此，IL-10和IFN-γ的分泌、表達(dá)與HPS的發(fā)病機(jī)制有一定的關(guān)系。本研究也發(fā)現(xiàn)膿毒癥患兒組及ALL患兒組IL-10升高，但與HPS患兒組比較，IL-10水平HPS患兒組是明顯高于膿毒癥患兒組及ALL患兒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因而IL-10水平異常增高相比于膿毒癥患兒組及ALL患兒組對(duì)HPS患兒組的診斷意義更大，HPS治療前IL-10水平較治療后明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮IL-10水平在HPS的治療效果及預(yù)后也有一定的指導(dǎo)意義。

IFN-γ主要由活化的Th細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。促進(jìn)誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞因子如Leukotrienes和IL-2；抑制其誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞因子如IL-10、cyclosporin A、dexamethasone。IFN-γ主要的生理作用是與它的受體結(jié)合后，通過蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）從而使酪氨酸磷酸化，磷酸化的產(chǎn)物叫做信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STATs），這種STATs與其他DNA結(jié)合蛋白而產(chǎn)生的復(fù)合體移到細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，之后與細(xì)胞核基因的上游增強(qiáng)子區(qū)段結(jié)合，從而引起細(xì)胞因子的表達(dá)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子間相互作用、相互影響，產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致HPS的發(fā)生。

表3 4組患兒細(xì)胞因子水平比較[M（QR）或，pg/mL]

表3 4組患兒細(xì)胞因子水平比較[M（QR）或，pg/mL]

與正常對(duì)照組比：aP＜0.05；與ALL患兒組比：bP＜0.05；與膿毒癥患兒組比：cP＜0.05

有研究表明IFN-γ在HPS中發(fā)揮了非常重要的作用，而且認(rèn)為IFN-γ＞30 U/mL是HPS的一個(gè)不良預(yù)后因子[9]。我們研究表明IFN-γ在HPS患兒組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IFN-γ水平異常增高，治療前后差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床提示患兒病情得到緩解，并且隨之細(xì)胞因子水平也明顯下降。IFN-γ水平的增高不但在HPS患兒組中是存在著，在膿毒癥患兒組和ALL患兒組中也可以看到，但是HPS患兒組治療前IFN-γ水平相較于正常對(duì)照組、ALL患兒組、膿毒癥患兒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮對(duì)于兒童HPS的診斷，IFN-γ水平的異常增高有一定的診斷特異性。

PRF1基因編碼定位于10q21-22，其PRF蛋白包括3個(gè)外顯子，編碼區(qū)在外顯子2及外顯子3。PRF1基因突變占家族性噬血細(xì)胞綜合征（familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，F(xiàn)HL）的20%～40%，突變率隨著種族的不同而不同[9-10]。本次穿孔素PRF1基因突變的研究，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)陽性病例，可能與收集的病例較少，F(xiàn)HL發(fā)病率低等有關(guān)系，需要我們進(jìn)一步努力為FHL基因診斷和遺傳咨詢打下一定的基礎(chǔ)。

我們目前研究發(fā)現(xiàn)血清IL-10、IFN-γ水平在HPS患兒治療前相比其他對(duì)照組呈顯著升高，治療后病情好轉(zhuǎn)時(shí)明顯下降，可以作為兒童HPS的早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

[1] Imashuku S. Advances in the management of hemophagocytic lymphohistiocytosis[J]. Int J Hematol, 2000, 72(1): 1-11.

[2] Tang Y, Xu X, Song H, et al. Early diagnostic and prognostic significance of a specific Th1/Th2 cytokine pattern in children with haemophagocytic syndrome[J]. Br J Hametol, 2008, 143(1): 84-91.

[3] 胡群, 張小玲. 噬血細(xì)胞綜合征診斷指南(2004)[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2008, 23(3): 235-236.

[4] Janka GE. Familial and acquired hemophagocytic lymphohistiocytosis[J]. Eur J Pediatr, 2007, 166(2): 95-109.

[5] 盧一麗, 錢江潮, 李原. 兒童噬血細(xì)胞綜合征臨床分析[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 36(1): 63-65.

[6] Tumpey TM, Cheng H, Yan XT, et al. Chemokine synthesis in the HSV-1-infected cornea and its suppression by interleukin-10[J]. J Leukoc Biol, 1998, 63(4): 486-492.

[7] Jabeen T, Leonard P, Jamaluddin H, et al. Structure of mouse IP-10, a chemokine[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2008, 64(Pt 6): 611-619.

[8] 唐偉, 劉煜, 劉超. 白介素-10與自身免疫性疾病[J]. 國外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè), 2005, 31(5): 206-209.

[9] Gürgey A, G??ü? S, Ozyürek E, et al. Primary hemophagocytic lymphohistiocytosis in Turkish children[J]. Pediatr Hematol Oncol, 2003, 20(5): 367-371.

[10] Al-Lamki Z, Wali YA, Pathare A, et al. Clinical and genetic studies of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis in Oman:need for early treatment[J]. Pediatr Hematol Oncol, 2003, 20(8): 603-609.

（本文編輯：吳彬）

IL-10, IFN-γ for the study of the significance of detecting for children with hemophagocytic syndrome

XU Zhisheng, ZHENG Shuangli, LI Yuan, ZENG Weiwei, CHEN Min, QIAN Jiangchao.
Department of Pediatric Hematology, the Second Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate serum IL-6, IL-10, IL-18, IFN-γ for the value of early diagnosis and prognosis of children with hemophagocytic syndrome. Methods: By using the method of prospective study of 20 children with a diagnosis of HPS into diagnosis before treatment and after treatment, while at the same time, with 20 cases normal physical examination children as normal control group, then choose the remission of acute lymphoblastic leukemia (ALL), 18 cases and sepsis were 22 cases of serum were chosen as positive control group. IL-6, IL-10, IL-18, IFN-γ levels were determined with fow cytometry instrument fow ball technique. Four kinds of cytokines serum levels before and after treatment between different groups were compared. Results: Four kinds of cytokines levels obriously varied with HPS before and after treatment in children, 4 kinds of cytokines during the diagnosis level was signifcantly higher than that of the normal control group after treatment (P＜0.05), children with HPS of IL-10 and level of IFN-γ obviously elevated compared with normal controls, children with acute leukemia and the cases of sepsis was signifcant difference (P＜0.05). Conclusion: Cytokines IL-10 and IFN-γ levels in children with HPS before treatment is signifcantly elevated compared with the control group, then markedly reduced for treatment, so it can be used as a children’s early diagnosis and prognosis prediction of HPS clinical indicator.

children; hemophagocytic lymphohistiocytosis; hemophagocytic syndrome; cytokines; value of diagnosis

R72

BDOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.016

2014-03-03

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20100055）。

徐智勝（1983-），男，浙江麗水人，住院醫(yī)師，碩士。

錢江潮，主任醫(yī)師，Email：qianjiangchao@vip. sohu.com。