高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水中13 種有機(jī)污染物

羅碧容 ， 錢 蜀， 謝振偉， 姚 歡， 熊 杰， 趙 紅

（四川省環(huán)境監(jiān)測(cè)總站，四川 成都610091）

有機(jī)污染物樂果、敵敵畏、敵百蟲、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、內(nèi)吸磷、丙烯酰胺、苯胺、聯(lián)苯胺、甲萘威、微囊藻毒素-LR、阿特拉津均屬于我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［1］嚴(yán)格控制的特定項(xiàng)目，也是全世界嚴(yán)格控制的環(huán)境污染物項(xiàng)目；苯胺與聯(lián)苯胺屬國(guó)際公認(rèn)的優(yōu)先監(jiān)測(cè)污染物之列；敵敵畏、樂果、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、敵百蟲屬于我國(guó)水中優(yōu)先控制污染物［2］；2008 年歐盟就明確規(guī)定禁止使用甲萘威［3］；阿特拉津被聯(lián)合國(guó)列入持久性有毒化學(xué)污染物名單，同時(shí)也被列為國(guó)際環(huán)境優(yōu)先控制污染物之一。這些有機(jī)污染物均可通過皮膚、呼吸道、消化道等途徑進(jìn)入人體，進(jìn)而使正常生理機(jī)能失調(diào)，引起病理性改變及毒害作用［4］。其中聯(lián)苯胺具有強(qiáng)致癌毒性且被國(guó)際癌癥研究中心確定為致癌物質(zhì)［5，6］；丙烯酰胺也被列為第2 類致癌物［7］；歐盟化學(xué)品審查委員會(huì)認(rèn)為甲萘威能引發(fā)腫瘤，屬第3 類致癌物質(zhì)［3］；微囊藻毒素是肝臟腫瘤的強(qiáng)烈促進(jìn)劑，同時(shí)還具有多器官毒性、神經(jīng)毒性、遺產(chǎn)毒性、致癌性、致突變性等毒害效應(yīng)；因而它們對(duì)環(huán)境和人類健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題。

這13 種化合物的性質(zhì)差異較大，還未見有同時(shí)分析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。而關(guān)于這些有機(jī)污染物的分析方法有氣相色譜法［8，9］、氣相色譜-質(zhì)譜法［10，11］、高效液相色譜法［12］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［13，14］、毛細(xì)管電泳法［15］、酶聯(lián)免疫法［16］等；前處理方法有固相萃取［8，10，12］、液液萃?。?1］、液液微萃取［9］、過膜-直接進(jìn)樣［13］等。

由于它們均屬我國(guó)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格控制的特定分析項(xiàng)目，為了簡(jiǎn)化環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法、提高分析工作效率與方法靈敏度，本方法通過優(yōu)化液相色譜條件及質(zhì)譜條件，建立了直接進(jìn)樣-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)快速分析這13 種有機(jī)污染物的方法，該法不需要前處理步驟，干擾小，可最大程度地反映出樣品的真實(shí)性與代表性，方法操作簡(jiǎn)單、快速，靈敏度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料及試劑

API4000QTrap 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公司）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；Kromasil 100-5 C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm，瑞典Kromasil 公司）；孔徑0.22 μm 尼龍66 濾膜（德國(guó)MEMBRANA 公司）；玻璃針筒。

甲醇（色譜純，J＆K Scientific Ltd.）；甲酸（HPLC 級(jí)，CNW Technologies）；100 mg／L 的樂果、敵敵畏、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、內(nèi)吸磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（以甲醇為溶劑，美國(guó)xStandard 公司）、1 000 mg／L 丙烯酰胺、阿特拉津標(biāo)準(zhǔn)溶液（以甲醇為溶劑，美國(guó)AccuStandard 公司）、100 mg／L 苯胺、聯(lián)苯胺、敵百蟲、甲萘威標(biāo)準(zhǔn)溶液（以甲醇為溶劑，美國(guó)AccuStandard 公司），20 mg／L 微囊藻毒素-LR 標(biāo)準(zhǔn)溶液（以甲醇為溶劑，國(guó)家環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所），各標(biāo)準(zhǔn)溶液置于-18 ℃避光保存。所有用水均為超純水。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲醇稀釋至質(zhì)量濃度均為10.0 mg／L，再以超純水稀釋這13 種有機(jī)污染物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，臨用時(shí)配制。

1.2 樣品采集與前處理

按照HJ／T 91、GB／T 14 581、HJ／T 164 和HJ／T 493 的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行水樣采集和保存。用棕色玻璃瓶采集，水樣要充滿樣品瓶并加蓋密封，4 ℃下避光保存。樣品采集后應(yīng)盡快分析，否則應(yīng)在4 ℃冰箱中冷藏保存，時(shí)間不超過7 天。樣品運(yùn)輸過程應(yīng)防震、低溫保存、避免陽光照射，還應(yīng)防止運(yùn)輸車內(nèi)污染。

水樣用玻璃針筒抽取并經(jīng)0.22 μm 尼龍66 濾膜過濾，除去較大顆粒物雜質(zhì)后進(jìn)樣分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18 柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.01% 甲酸水溶液；梯度洗脫：0.7 ～1.0 min，20% A ～70%A；1.0 ～4.0 min，70% A ～95% A；4.0 ～5.0 min，95% A；5.1 ～10.0 min，20% A。流 速：0.5 mL／min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式（ESI＋）電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣壓力1.72×105Pa，霧化氣壓力3.79×105Pa，輔助氣壓力4.14×105Pa，輔助氣溫度600 ℃，碰撞氣設(shè)置Medium。13 種有機(jī)污染物的質(zhì)譜條件見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

13 種目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異大，應(yīng)用不同的色譜柱響應(yīng)值與分離情況差距也較大。本實(shí)驗(yàn)分別比較了色譜柱①SUPELCOSIL LC-DABS（150 mm×4.6 mm，3 μm），②SUPELCODIS COVERY C18（100 mm×2.1 mm，5 μm），③Kromasil 100-5 C18（150 mm×2.1 mm，5 μm），④Shim-pack XRODS11（75 mm×2.0 mm，2.2 μm），⑤Thermo Hypersil GOLD（150 mm×4.6 mm，5 μm），⑥Thermo ODS HYPERSIL（100 mm×2.1 mm，5 μm）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯胺在柱①上沒有響應(yīng)峰，微囊藻毒素-LR 在柱①⑤⑥上沒有響應(yīng)峰，而甲基對(duì)硫磷在柱⑤上沒有響應(yīng)峰；柱④壓力太高，并且13 種化合物的保留時(shí)間都很短，分離度差；若降低流速，則聯(lián)苯胺、甲萘威、阿特拉津、敵敵畏、樂果、敵百蟲峰嚴(yán)重展寬，且出現(xiàn)裂峰；柱③與②比較，柱②上有8種化合物峰不對(duì)稱、明顯拖尾，而大多數(shù)化合物在柱③上的峰形都較為理想，且保留時(shí)間較長(zhǎng)，各化合物分離程度稍微好一點(diǎn)。因而，本實(shí)驗(yàn)選擇色譜柱③Kromasil 100-5 C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）為分離柱。

表1 13 種有機(jī)污染物的質(zhì)譜條件Table 1 MS／MS conditions of organic pollutants

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

以Kromasil 100-5 C18 為分析柱，比較pH 值分別為4.0、5.0、6.0、6.7 的甲醇-10 mmol／L 乙酸銨緩沖液以及甲醇-水等流動(dòng)相對(duì)化合物的保留時(shí)間及響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明目標(biāo)化合物的峰形、峰寬及響應(yīng)值均沒有明顯差異。

改用甲醇-0.1% 甲酸溶液或甲醇-0.1% 乙酸溶液作流動(dòng)相時(shí)，部分目標(biāo)化合物的響應(yīng)值明顯提高，尤其是苯胺、對(duì)硫磷和甲基對(duì)硫磷；但流動(dòng)相為甲醇-0.1% 乙酸溶液時(shí)，聯(lián)苯胺和敵敵畏峰展寬明顯，且聯(lián)苯胺出現(xiàn)裂峰。說明酸性流動(dòng)相更有利于固定相上的硅醇基質(zhì)子化，減少目標(biāo)化合物與硅醇發(fā)生反應(yīng)而引起二次保留；同時(shí)也說明甲酸的酸性較強(qiáng)。

比較了不同甲酸含量（0.01%、0.02、0.05%、0.1%）的流動(dòng)相的分離效果。發(fā)現(xiàn)隨著甲酸比例的減少，多數(shù)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值提高，苯胺的峰形改善。說明流動(dòng)相的酸強(qiáng)度不僅影響色譜柱固定相上的硅醇基質(zhì)子化程度，同時(shí)還影響樣品目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性。因此選擇添加0.01% 甲酸。

將甲醇改成乙腈時(shí)，多數(shù)化合物的響應(yīng)值明顯降低、保留時(shí)間提前；這主要是因?yàn)橐译娴南疵撃芰Ρ燃状紡?qiáng)，而在質(zhì)譜分析中，乙腈溶液的離子化效率要比甲醇低。

因此，最后選擇甲醇-0.01% 甲酸水溶液作為本實(shí)驗(yàn)分析方法的流動(dòng)相。

2.1.3 流速的選擇

在確定了色譜柱和流動(dòng)相的情況下，對(duì)流動(dòng)相的流速進(jìn)行了優(yōu)化選擇?？疾炝?.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL／min 5 個(gè)不同流速；發(fā)現(xiàn)流速越低，目標(biāo)化合物響應(yīng)值越高，但色譜峰嚴(yán)重展寬；0.2 mL／min 時(shí)，樂果、敵百蟲峰寬達(dá)0.75 min，聯(lián)苯胺不僅峰展寬明顯且出現(xiàn)裂峰；隨著流速提高，目標(biāo)化合物峰寬縮小，當(dāng)流速達(dá)到0.5 mL／min 時(shí)，峰寬與響應(yīng)值變化趨于平穩(wěn)。這主要因?yàn)榱魉偬撸|(zhì)譜的離子化效率降低；流速太低，化合物的保留時(shí)間延長(zhǎng)容易引起峰拖尾甚至分裂。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇流速為0.5 mL／min。

2.1.4 柱溫的選擇

在以上優(yōu)化條件下，考察柱溫對(duì)化合物的保留時(shí)間及響應(yīng)值的影響情況?？疾炝?5、30、35、40 ℃4 個(gè)不同的柱溫條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間受柱溫的影響不是很明顯；隨著柱溫升高，微囊藻毒素-LR 的響應(yīng)值提高；柱溫為25 ～30 ℃時(shí)，苯胺峰展寬明顯并出現(xiàn)裂峰；當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷、微囊藻毒素-LR 的響應(yīng)值均有所提高，苯胺和敵百蟲的峰形有所改善。這主要因?yàn)橹鶞氐奶岣呒扔欣诹鲃?dòng)相洗脫能力的提高而改善峰形，又有利于化合物在色譜柱上的平衡而提高響應(yīng)值。所以本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用甲醇溶液分別配制質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以注射泵方式連接，流速10 μL／min，對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，包括確定母離子與子離子、去簇電壓、入口電壓、碰撞池出口電壓、碰撞能量。

以優(yōu)化的色譜條件與化合物質(zhì)譜參數(shù)，建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，不接樣品分析柱，用20.0 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)質(zhì)譜離子化參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，包括：噴霧電壓、霧化氣、輔助氣、輔助氣溫度、氣簾氣。最后選擇參數(shù)見1.3 節(jié)中的質(zhì)譜條件。

以優(yōu)化的色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行曲線繪制、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限等實(shí)驗(yàn)，13 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖1。

2.3 濾膜的選擇

在確定以上液相色譜與質(zhì)譜條件下，考察不同材質(zhì)的濾膜對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。用超純水配制一定濃度的空白加標(biāo)樣品，分別經(jīng)0.22 μm 的聚醚砜、尼龍66、醋酸纖維濾膜過濾，然后進(jìn)行HPLC-MS／MS 分析；發(fā)現(xiàn)醋酸纖維濾膜對(duì)內(nèi)吸磷、馬拉硫磷影響較大；聚醚砜與尼龍66 濾膜對(duì)化合物回收率的影響較小，其中對(duì)硫磷用尼龍材質(zhì)的濾膜回收率要稍微好一點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用尼龍66 濾膜為樣品過濾濾膜。

圖1 13 種有機(jī)污染物標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖（50.0 μg／L）Fig.1 MRM chromatograms of the 13 organic standard solutions（50.0 μg／L）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將10.0 mg／L 的13 種目標(biāo)化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。可以看出，13 種有機(jī)污染物在一定濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系（r≥0.999 5）。

表2 13 種有機(jī)污染物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear ranges，regression equations and correlation coefficients （r）of the 13 organic pollutants

2.5 精密度與檢出限

根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ168-2010）中的檢出限試驗(yàn)方法，對(duì)目標(biāo)化合物含量為檢出限2 ～5 倍的樣品進(jìn)行7 次平行測(cè)定，計(jì)算檢出限LOD ＝3.143S（3.143 為自由度是6、置信度為99% 的t 值；S 為標(biāo)準(zhǔn)偏差），13 種有機(jī)污染物的檢出限在0.02 ～0.10 μg／L 范圍內(nèi)，均明顯低于《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838-2002）的標(biāo)準(zhǔn)限值（見表3）。分別對(duì)0.50、2.00、10.0 μg／L 3 個(gè)水平濃度的加標(biāo)樣品進(jìn)行6 次平行測(cè)定，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以此考察方法的精密度。13 種有機(jī)污染物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5% ～5.0% 范圍內(nèi)（見表3）。

表3 13 種有機(jī)污染物的標(biāo)準(zhǔn)限值、檢出限及精密度Table 3 Standard limits，limits of detection （LODs）and precisions （RSDs）of the 13 organic pollutants

2.6 實(shí)際樣品分析與方法準(zhǔn)確度

采集某集中式生活飲用水源地地表水和某垃圾填埋場(chǎng)地下水，用尼龍66 濾膜過濾后進(jìn)行分析測(cè)定，13 種有機(jī)污染物均未檢出。采用實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)定回收率的方法來考察方法準(zhǔn)確度，加標(biāo)濃度在0.20 ～100 μg／L 范圍內(nèi)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果如表4 所示，13 種有機(jī)污染物的加標(biāo)平均回收率在81.2% ～112% 之間。

表4 13 種有機(jī)污染物在空白樣品中的加標(biāo)回收率Table 4 Recoveries of the 13 organic pollutants spiked in blank environmental samples

3 結(jié)論

本文建立了濾膜過濾-直接進(jìn)樣-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定水中13 種有機(jī)污染物的分析方法。該方法靈敏度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，13 種化合物在10 min 內(nèi)完成分析，方法檢出限為0.02 ～0.10 μg／L，明顯低于《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》限值0.5 ～100 μg／L；低、中、高3 個(gè)添加濃度水平的樣品實(shí)驗(yàn)，13 種化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于5.0%，地表水與地下水樣品加標(biāo)平均回收率為81.2% ～112%，滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制要求［17］。對(duì)于其他基質(zhì)更為復(fù)雜的環(huán)境廢水樣品，可通過固相萃取、固相微萃取等方式進(jìn)行富集與凈化后，進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析。

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